丙型肝炎病毒核酸國家標準物質(zhì)的研究.pdf

1、背景和目的 丙型肝炎病毒核酸(HCVRNA)檢測缺乏統(tǒng)一的定量標準，給臨床的診斷和治療帶來了很多問題。研制國內(nèi)用于HCVRNA擴增檢測的血清標準物質(zhì)，推進核酸檢測的標準化。構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，表達內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性。替代凍干血清的標準品，使其具有更好的臨床適用性。 方法 1、選擇HCV陽性血漿，用

2、熒光定量PCR檢測試劑進行初步檢測，再用陰性的獻血員血漿，除纖維蛋白原(纖原)后進行稀釋。采用國際公認的PCR內(nèi)標定量方法，即ROCHE公司COBASAMPLICOR及相應(yīng)試劑進行檢測，以WHO標準品(NIBSC編號96/790)進行比對定值。 2、將該定值制備物發(fā)放給HCVRNA熒光定量試劑的生產(chǎn)廠家進行檢測。 3、由于HCV分型和HCVRNA定量檢測試劑盒，所檢測的區(qū)域主要集中在5'-UTR區(qū)，因此本研究擬選用5'-

3、UTR區(qū)作為MS2噬菌體的包裝序列。引物5'端引入HindⅢ酶切位點。PCR產(chǎn)物進行T載體克隆后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切獲得所需要的目的片段，與用HindⅢ酶切的表達載體pNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達載體pNCCL1-HCV。在IPTG誘導(dǎo)下，衣殼蛋白會在攜帶有pET-MS2-HCV的細菌中表達，并與reRNA組裝成病毒樣顆粒。誘導(dǎo)后的細菌經(jīng)超聲碎菌，離心后即可得到含病毒樣顆粒的上清。為驗證包裝的核酸為HCVreRNA，取20μ

4、l上清按1∶10至1∶106比例稀釋后，依照異硫氰酸胍鹽提取RNA的方法提取VLPs的RNA，然后進行RT-PCR。取20μl所得到的上清，加入RNaseA(100U)和DNaseI(20U)，37℃,溫育4天以觀察病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。將病毒樣顆粒用PEG6000沉淀后，加入正常人陰性血清，取20μl于45℃放置3天觀察病毒樣顆粒是否適合運輸。 結(jié)論 第一部分:研究獲得的定值凍干血清是我國第一個用于核酸檢測的標準品。由于該

5、標準物質(zhì)基質(zhì)為凍干血清，含有完整的病毒核酸序列，與臨床檢測的病人標本一致，具有很好的臨床適用性。推廣范圍包括各個HCVRNA檢測試劑生產(chǎn)廠家、醫(yī)院臨床基因擴增檢驗實驗室及進行核酸篩查的血站等。該標準物質(zhì)，在國內(nèi)主要PCR檢測試劑的生產(chǎn)廠家均得到了應(yīng)用，在穩(wěn)定性及定值的準確性方面得到了充分肯定。由該標準物質(zhì)傳遞的血清基質(zhì)的標準曲線，由于血清基質(zhì)的標準曲線同待測樣本一樣經(jīng)過純化和逆轉(zhuǎn)錄步驟，消除了標準品與樣本間提取效率和逆轉(zhuǎn)錄效率檢測差異，

6、同時消除了不同試劑不同人員操作間的差異，又具有溯源性，使檢測結(jié)果準確并具有可比性，因此該標準物質(zhì)在臨床基因擴增定量檢測HCVRNA方面有廣闊的應(yīng)用前景，將有力的促進臨床HBVDNA和HCVRNA定量檢測的標準化。 第二部分:研究得到的表達載體pET-MS2-HCV及原核表達系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNase的HCVRNA標準品和質(zhì)控品的平臺。獲得了HCV1b、2a、6a型三種基因型病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒可以直接作為作為凍干血