特異性靶向IRES的抗丙型肝炎病毒核酸藥物及影響IRES功能的因素研究.pdf

1、該研究的目的是以IRES作為HCV基因治療的作用靶位,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和脫氧核酶技術(shù)進(jìn)行抗丙型肝炎核酸藥物研究.司時探討了影響IRES功能的各種因素,如IFN、酒精、PTB、La蛋白以及HCV的幾種非結(jié)構(gòu)蛋白等.缺乏合適的HCV感染細(xì)胞及小動物模型,是目前抗HCV藥物研究和開發(fā)的主要障礙之一.因此構(gòu)建一種HCV IRES介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的細(xì)胞及小動物模型,可為以HCV IRES為靶標(biāo)的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV

2、藥物的評價及篩選創(chuàng)造條件.該實驗所用HepG2.9706細(xì)胞株是HCV IRES介導(dǎo)熒光素酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型.HCV IRES與熒光素酶基因融合,熒光素酶基因的起始密碼及調(diào)控序列均已切除,熒光素酶的翻譯由HCV IRES介導(dǎo)啟動.因此HepG2.9706細(xì)胞中熒光素酶活性表達(dá)的高低,可反映HCV IRES基因的功能,易于定量、簡單易測.在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染法將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi),在小鼠肝臟可檢測到高水平螢火蟲熒光素酶的表

3、達(dá).從而初步建立了可以瞬時評價靶向HCV IRES藥物作用的細(xì)胞及小動物模型,為抗HCV反義藥物研究奠定了基礎(chǔ).在實驗中,我們選擇了T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄形成siRNA和質(zhì)粒表達(dá)shRNA兩種方法.該研究選用了含10-23基序的Dz10~23結(jié)構(gòu).它的底物結(jié)合臂與底物間的作用是完全通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick配對.改變底物識別結(jié)構(gòu)域的序列,Dz便能識別不司的RNA底物.針對HCV IRES設(shè)計合成了5條Dz,評價其對目的基因的抑

4、制作用效果.目前,干擾素是國際上唯一公認(rèn)的治療丙型肝炎的藥物.但I(xiàn)FN抗HCV作用機(jī)制并不完全清楚.該研究探討了IFN對帽子依賴的翻譯機(jī)制和HCV IRES介導(dǎo)的內(nèi)部起始翻譯機(jī)制的抑制效果.該研究建立了由HCV IRES介導(dǎo)熒光素酶基因表達(dá)的細(xì)胞及小動物模型,并應(yīng)用這兩種模型評價了特異性靶向HCV IRES的siRNA和脫氧核酶對靶標(biāo)的抑制作用.同時對影響HCV IRES功能的一些主要因素進(jìn)行了初步探討,為今后進(jìn)行抗HCV的基因治療奠定