避免乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實時熒光PCR方法的研究及其內標的建立.pdf

1、第一部分避免乙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實時熒光PCR方法的研究及其內標的建立
　　 目的：
　　 建立避免乙型肝炎病毒核酸漏檢的新型雙重實時熒光PCR測定方法，最大限度的避免乙型肝炎病毒感染者的漏檢；同時制備對人無生物傳染性、穩(wěn)定的、耐DNase和RNase的、防止假陰性結果的內標，使實驗結果更加可靠。
　　 方法：
　　 我們從美國Los Alamos國家實驗室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站上下載所有的HBV序列，

2、采用序列比對軟件DNAMAN進行分析，查找保守區(qū)域。然后針對保守區(qū)域設計引物和探針，初步建立實時熒光PCR檢測體系。
　　 我們按照引物探針設計的基本原則，針對HBV基因組的保守區(qū)域設計許多組備選的引物探針，將那些能互補的檢測所有類型HBV的引物探針兩兩組合，對一些HBV陽性樣本進行檢測，看能否起到檢測能力增強的作用，選出最佳的2組引物探針組合，初步建立雙引物雙探針檢測體系。
　　 根據(jù)前面篩選出的最佳探針序列在HBV基

3、因組中的位置，采用重疊延伸PCR技術將原來的檢測探針結合區(qū)突變?yōu)閮葮颂结樈Y合區(qū)。為了使內標更加穩(wěn)定，我們根據(jù)lambda噬菌體的克隆步驟使用了lambda噬菌體gt11載體和EcoRI的限制性酶切位點，采用體外包裝技術構建了耐DNase酶和RNase酶的噬菌體內標，然后通過棋盤法確定了內標噬菌體在雙引物雙探針檢測體系中的最佳摻入量。
　　 我們使用雙引物雙探針檢測體系對不同濃度的HBV DNA國際標準品進行了檢測，并采用上述構建

4、的噬菌體作為內標進行假陰性質控，考察了所建立方法的檢測下限和特異性。通過大量臨床樣本，比較了單引物單探針、雙引物雙探針以及國內一些商品試劑盒的檢測能力和臨床適用性。
　　 結果：
　　 通過大量臨床樣本的篩選，最終建立了檢測性能最好的雙引物雙探針檢測體系。成功的使用Lambda噬菌體包裝技術構建了耐DNase和RNase的、對人無生物傳染危險性的噬菌體，經(jīng)過棋盤法篩選后，采用1000copies/ml的噬菌體顆粒作為防止

5、假陰性結果的內標。
　　 本研究建立的雙引物雙探針體系的檢測下限為29.5IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線性R=0.993。在對69份臨床樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)雙引物雙探針體系的檢測能力與羅氏公司的COBAS AmpliPrcp（CAP）/COBAS TaqMan（CTM）HBV檢測結果一致，明顯優(yōu)于單引物單探針檢測以及國產(chǎn)HBV熒光定量檢測試劑盒（上?？迫AHBV熒光定量檢測試劑盒）。
　　 結論：
　　 本研

6、究建立的雙引物雙探針檢測HBV DNA實時熒光PCR方法的檢測下限為29.5 IU/ml，特異性為100％，檢測線性R=0.993。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性，并且成本要低于羅氏公司的實時熒光PCR檢測試劑盒，適于大規(guī)模的推廣以及在發(fā)展中國家中應用。
　　 本研究采用的Lambda噬菌體包裝系統(tǒng)可以作為構建armored DNA的較好平臺。此方法制備的armored DNA具有穩(wěn)定性好、DNase酶抗性以及對人

7、無生物傳染危險性等優(yōu)點，可以作為內標對HBV DNA檢測的全過程進行監(jiān)測，防止假陰性結果的發(fā)生。
　　 第二部分避免丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型實時熒光PCR方法的研究及其內標的建立
　　 目的：
　　 建立避免丙型肝炎病毒核酸漏檢的新型雙重實時熒光RT-PCR檢測方法，最大限度的避免丙型肝炎病毒感染者的漏檢；同時制備無生物傳染性、穩(wěn)定的、耐DNase和RNase的、防止假陰性結果的內標，使實驗結果更加可靠。

8、>　　 方法：
　　 為了能精確的顯示HCV基因組的保守區(qū)域，我們從美國Los Alamos國家實驗室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站上下載所有的HCV序列，采用序列比對軟件DNAMAN進行分析，查找保守區(qū)域。然后針對保守區(qū)域設計引物和探針，初步建立實時熒光RT-PCR檢測體系。
　　 我們按照引物探針設計的基本原則，針對HCV基因組的保守區(qū)域（5’UTR）設計許多組備選的引物探針，將那些能互補的檢測所有HCV基因型和亞型的引物探針

9、兩兩組合，通過對一些臨床HCV陽性樣本檢測，看能否起到檢測能力增強的作用，選出最佳的2組引物探針組合，初步建立雙引物雙探針檢測體系。根據(jù)篩選出的最佳探針序列在HCV基因組中的位置，采用重疊延伸PCR技術構建重組質粒，利用MS2噬菌體蛋白質和基因組RNA相互作用的機制及噬菌體衣殼蛋白空間構象的特點進行噬菌體顆粒的包裝，表達出內含HCV RNA的內標病毒樣顆粒，并使用不同濃度的內標病毒樣顆粒分別摻入到高、中、低濃度的HCV血清中進行擴增，確

10、定內標病毒樣顆粒在反應中的最佳濃度。
　　 我們使用雙引物雙探針檢測體系對不同濃度的HCV RNA國際標準品進行了檢測，并采用內標病毒樣顆粒進行假陰性質控，考察了所建立方法的檢測下限和特異性。通過大量臨床樣本，比較了單引物單探針、雙引物雙探針以及國內、國際一些商品試劑盒的檢測能力和臨床適用性。
　　 結果：
　　 通過大量臨床樣本的篩選，最終建立了檢測性能最好的雙引物雙探針檢測體系。成功的使用1000copies

11、/ml的病毒樣顆粒作為防止假陰性結果的內標，建立的雙引物雙探針體系的檢測下線為38.99 IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線性R=0.998。在對深圳市血液中心的109份血清樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)雙引物雙探針體系的檢測結果與羅氏公司的COBAS AmpliPrep（CAP）/COBAS TaqMan（CTM）檢測結果一致，明顯優(yōu)于兩種國產(chǎn)HCV熒光定量檢測試劑盒（上海科華HCV熒光定量檢測試劑盒和杭州博日HCV熒光定量檢測試劑盒）。

12、r>　　 結論：
　　 本研究建立的雙引物雙探針檢測HCV RNA實時熒光RT-PCR方法的檢測下限為38.99 IU/ml，檢測特異性為100％，檢測線形R=0.998，并能檢測出所有的HCV基因型。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性，并且雙引物雙探針檢測體系的成本要低于羅氏公司的CAP/CTM試劑盒，更適于大規(guī)模的推廣以及在發(fā)展中國家中應用。
　　 本研究制備的armored RNA具有穩(wěn)定性好、DNas