EndMT在高PTH血癥介導(dǎo)的CKD心血管病變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致該類患者死亡的首位病因。隨著腎功能的下降，CKD患者常出現(xiàn)血清甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)水平異常升高的現(xiàn)象。既往，臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，高PTH血癥可誘導(dǎo)心臟纖維化病變和血管鈣化的形成，是CVD發(fā)生率和死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;但

2、其具體機(jī)制仍不十分清楚。近年來，研究證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）是介導(dǎo)心臟纖維化進(jìn)展的重要細(xì)胞學(xué)機(jī)制，且發(fā)生EndMT的細(xì)胞可獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)表型并分化為骨樣細(xì)胞參與異位鈣化病變的形成。因此，本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察EndMT是否參與介導(dǎo)高PTH血癥相關(guān)CKD心臟纖維化和血管鈣化的形成，并初步探討

3、上述細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的潛在分子機(jī)制。
　　方法：在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先構(gòu)建腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎功能衰竭(chronic renalfailure，CRF)模型大鼠，檢測(cè)了該模型大鼠在接受西那卡塞（cinacalcet, CINA）降PTH治療后心臟纖維化病變及EndMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，并觀察PTH對(duì)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs) EndMT標(biāo)志物表達(dá)的影響;在第二部分，我們通過體外實(shí)驗(yàn)觀察經(jīng)典的Wnt/β-caten

4、in徑路活化在PTH所誘導(dǎo)EndMT中的作用;在第三部分實(shí)驗(yàn)中，我們分別在CRF大鼠模型和PTH灌注的內(nèi)皮細(xì)胞示蹤小鼠(Tie2-Cre×Tmt mice)模型中觀察主動(dòng)脈鈣化與內(nèi)皮-軟骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，并在體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)PTH對(duì)EndMT后軟骨細(xì)胞分化潛能的影響。在第四部分，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用β-catenin siRNA和Wnt通路抑制劑DKK1部分阻斷PTH誘導(dǎo)的EndMT，觀察其對(duì)細(xì)胞MSC標(biāo)志物和軟骨細(xì)胞分化潛能的影響

5、。
　　結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CRF組大鼠血肌酐、尿素氮和尿蛋白含量顯著升高，提示CRF造模成功。與對(duì)照組相比，CRF組大鼠血PTH和血磷水平顯著增加，而血鈣水平則顯著降低。CINA治療后，CRF大鼠血PTH水平顯著下降。而血鈣、血磷濃度和鈣磷乘積則與治療前無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，CRF組大鼠心臟纖維化病變程度和EndMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加;而CINA治療后，上述指標(biāo)的表達(dá)亦明顯下調(diào)。隨后，體

6、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HAECs表達(dá)PTH受體，PTH呈濃度及時(shí)間依賴性的上調(diào)HAECs間充質(zhì)標(biāo)志蛋白FSP1和α-SMA的表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD31的表達(dá)水平。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度PTH誘導(dǎo)HAECs發(fā)生β-catenin核轉(zhuǎn)位;應(yīng)用β-catenin siRNA或DKK1干預(yù)可部分阻斷PTH所誘導(dǎo)的EndMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRF組大鼠主動(dòng)脈中膜鈣化面積較對(duì)照組顯著增加，并伴隨EndMT相關(guān)標(biāo)志

7、物、MSC和軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)增加;而接受CINA降PTH治療的CRF模型大鼠主動(dòng)脈中膜鈣化病變則較CRF模型組大鼠顯著減輕，同時(shí)，EndMT相關(guān)標(biāo)志物和MSC、軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)均下調(diào)。給予內(nèi)皮細(xì)胞熒光示蹤小鼠超生理劑量的PTH灌注后，模型組小鼠主動(dòng)脈壁內(nèi)出現(xiàn)鈣化斑，并表達(dá)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物;同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞示蹤熒光不僅出現(xiàn)在主動(dòng)脈內(nèi)壁內(nèi)皮細(xì)胞層，同樣出現(xiàn)在主動(dòng)脈內(nèi)膜下及中膜層，且部分細(xì)胞共表達(dá)軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

8、示，超生理劑量PTH誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EndMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)的同時(shí)MSC相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平亦明顯升高;后者接受軟骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7-14天后，軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白、軟骨基質(zhì)和細(xì)胞鈣含量均顯著增加。第四部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用β-catenin siRNA和DKK1抑制高濃度PTH誘導(dǎo)的EndMT后，MSC標(biāo)志物的表達(dá)水平下調(diào)，在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白水平也顯著下降。
　　結(jié)論：1.在CKD進(jìn)展過程中，高濃度的PTH可通過誘導(dǎo)