DLK1在胃腸道間質(zhì)瘤中上調(diào)表達(dá)的臨床意義及細(xì)胞功能研究.pdf

1、[目的]通過臨床腫瘤組織及血清學(xué)檢測(cè)，結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討DLK1與胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)系，明確DLK1基因在GIST腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)與GIST復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的臨床相關(guān)性及細(xì)胞作用機(jī)制。
　　[方法](1)通過小樣本高通量篩選，應(yīng)用NimbleGenTMmicroarray分析12例不同危險(xiǎn)度GIST組織標(biāo)本中差異基因表達(dá)譜，并應(yīng)用SYBR(@)Green

2、qPCR法在36例新鮮凍存的GIST組織中驗(yàn)證芯片結(jié)果，從中挑選出隨GIST危險(xiǎn)度升高，表達(dá)差異最大的基因DLK1。(2)搜集GIST腫瘤組織及瘤旁組織石蠟標(biāo)本，構(gòu)建GIST組織芯片，通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DLK1在不同危險(xiǎn)度腫瘤及瘤旁組織的表達(dá)情況，結(jié)合相應(yīng)GIST患者的臨床病理資料及術(shù)后隨訪結(jié)果，比較DLK1蛋白表達(dá)與患者危險(xiǎn)度分級(jí)和臨床預(yù)后的相關(guān)性。(3)以臨床GIST患者的隨訪結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，通過診斷均一性及準(zhǔn)確性兩方面比較美

3、國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutedofHealth，NIH)危險(xiǎn)度分級(jí)與DLK1分級(jí)方法對(duì)GIST患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。(4)通過ELISA法檢測(cè)DLK1的可溶性大片段蛋白FA1在不同危險(xiǎn)度GIST患者血清中的濃度，并比較其與其它消化道腫瘤或正常人群的表達(dá)差異，并繪制ROC曲線，明確血清FA1濃度評(píng)估GIST危險(xiǎn)度的臨床診斷價(jià)值。(5)利用親和層析法純化FA1蛋白，并構(gòu)建DLK1基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染GIST882

4、細(xì)胞并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。分別檢測(cè)經(jīng)FA1蛋白液作用及DLK1基因過表達(dá)后，對(duì)GIST細(xì)胞增殖、周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　[結(jié)果](1)通過表達(dá)譜芯片，篩選出候選基因共59個(gè)，其中29個(gè)基因隨著GIST危險(xiǎn)度增加表達(dá)上調(diào)，30個(gè)基因隨著GIST危險(xiǎn)度增加表達(dá)下調(diào)。根據(jù)基因表達(dá)的差異顯著性，以及對(duì)以上基因已知功能及相關(guān)文獻(xiàn)的網(wǎng)絡(luò)檢索，從中挑選出29個(gè)可能與GIST預(yù)后相關(guān)的候選基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。芯片篩選及PCR驗(yàn)證結(jié)果均顯示

5、，DLK1在低危組中呈低表達(dá)，而在高危組中呈顯著高表達(dá)，兩組間表達(dá)量相差477.85倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)。(2)組織芯片的免疫組化染色的結(jié)果顯示DLK1在腫瘤組織的強(qiáng)陽性表達(dá)率為31.6％，明顯高于瘤旁正常組織5％的強(qiáng)陽性率(P＜0.001);在腫瘤組織中，DLK1的蛋白表達(dá)與腫瘤大小(P=0.002)、核分裂相（P＜0.001）、危險(xiǎn)度分級(jí)(P＜0.001)、術(shù)后生存率(P＜0.001)以及術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移率(P＜0.

6、001)均顯著相關(guān)，隨著腫瘤體積增大、核分裂相增加及危險(xiǎn)度增高，腫瘤組織的DLK1染色的強(qiáng)陽性率顯著增加。(3)結(jié)合GIST患者的術(shù)后隨訪資料繪制Kaplan-Meier生存曲線。DLK1陰性組患者的5年預(yù)計(jì)總生存率(OverallSurvival，OS)為97.3％，弱陽性組為89.0％，而強(qiáng)陽性組為67.9％，陰性組和弱陽性組之間P值為0.267，弱陽性組和強(qiáng)陽性組之間的P值＜0.001，后者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;DLK1陰性組患者的預(yù)計(jì)

7、5年無復(fù)發(fā)生存率（Relapse-freeSurvival，RFS）為90.3％，弱陽性組為71.2％，而強(qiáng)陽性組為56.8％，陰性組和弱陽性組，以及弱陽性組和強(qiáng)陽性組之間的P值分別為0.009和0.015，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)將DLK1與NIH危險(xiǎn)度分級(jí)相互交叉再分布，結(jié)果顯示在NIH中低危組中，DLK1表達(dá)強(qiáng)陽性的患者，其術(shù)后5年RFS(77.1％和58.3％)明顯低于DLK1表達(dá)陰性或弱陽性的患者(97.7％和100％)，P值

8、分別為＜0.001和0.006;同時(shí)，在DLK1陰性/弱陽性組中，NIH分級(jí)為高危的患者，其手術(shù)后的5年RFS(39％)也明顯低于NIH中低危的患者(97.7％和100％)。而在DLK1強(qiáng)陽性組及NIH高危組中，再分布的各亞組間的5年RFS沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);兩種危險(xiǎn)度分級(jí)的ROC曲線顯示，DLK1和NIH分級(jí)的對(duì)應(yīng)曲線下面積(AreaUndertheCurve，AUC)分別為0.797±0.031和0.706±0.037，

9、兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。(5)不同人群的血清FA1經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，健康人群組的血清FA1平均濃度為0.156ng/ml(0.08～0.38ng/ml)，胃腸癌組的FA1平均濃度為0.101ng/ml(0.06～0.19ng/ml)，中低危GIST患者的FA1平均濃度為0.139ng/ml(0.10～0.25ng/ml)。胃腸癌及中低危GIST組與健康人群組比較，P值分別為0.097和0.331，均無顯著性差

10、異。高危GIST患者的血清FA1的術(shù)前平均濃度為0.437ng/ml(0.09～1.70ng/ml)，其中9例術(shù)后血清FA1濃度為0.152ng/ml(0.11～0.21ng/ml)。手術(shù)前、后兩組比較，P值＜0.001，有顯著性差異。高危GIST術(shù)前組血清FA1濃度分別與健康人群組、胃癌腸癌組及中低危GIST組比較，P值分別為0.047、0.025及＜0.001，均具有顯著性差異。(6)根據(jù)血清FA1濃度繪制ROC曲線，結(jié)果顯示FA1

11、診斷高危GIST的AUC為0.748±0.085，參考約登指數(shù)法(Youden'sindex)確定診斷臨界值為0.29ng/ml，此時(shí)FA1診斷高危GIST的靈敏度為46.2％，特異度為98.6％。(7)FA1蛋白處理后GIST細(xì)胞增殖活性增加，且各處理組細(xì)胞增殖活性隨FA1蛋白處理濃度升高而呈階梯式增加。蛋白液處理72小時(shí)后，500ng/ml、100ng/ml、50ng/mlFA(1)處理組及空白對(duì)照組細(xì)胞指數(shù)(CellIndex)分

12、別為2.31±0.09、1.9±0.13、1.88±0.07和1.76±0.11，500ng/ml組與其余各組間細(xì)胞指數(shù)P值均＜0.05，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;DLK1過表達(dá)細(xì)胞的增殖活性顯著高于對(duì)照組。DLK1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，CCK-8吸光度值(opticaldensity，OD)較對(duì)照組出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。(8)經(jīng)500ng/mlFA1蛋白處理48小時(shí)后，處理組進(jìn)入S期細(xì)胞比例平均為29.31±1.58％，顯著高

13、于對(duì)照組13.79±1.83％的平均S期細(xì)胞比例(P＜0.05);同時(shí)，對(duì)照組中G0/G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也顯著高于FA1處理組，平均細(xì)胞比例分別為78.21±2.94％和40.90±2.01％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;與FA1蛋白處理組相似，DLK1過表達(dá)組進(jìn)入S期細(xì)胞也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，同時(shí)停滯于G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。(9)FA1處理組和DLK1過表達(dá)組的GIST882細(xì)胞凋亡率分別

14、為12.86±1.29％、11.73±2.39％，與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　[結(jié)論](1)DLK1在腫瘤組織中表達(dá)顯著高于瘤旁正常組織，并且低危GIST腫瘤組織中呈低表達(dá)，在高危GIST腫瘤組織中呈高表達(dá)，且表達(dá)程度與GIST患者的復(fù)發(fā)率和生存率均密切相關(guān)，可作為除NIH危險(xiǎn)度分級(jí)之外評(píng)估GIST患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)另一可能的參考指標(biāo)。(2)術(shù)前血清FA1濃度升高的GIST患者，其術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，F(xiàn)A1可作為