乙型肝炎表面抗原主蛋白與烯酰輔酶A水合酶相互作用對(duì)細(xì)胞脂代謝影響的研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)在人肝癌細(xì)胞株HepG2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乙型肝炎表面抗原主蛋白（small hepatitis b surface antigen，SHBs），觀察SHBs與烯酰輔酶A水合酶(enoyl Coa hydratase，ECHS1)相互作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響，初步探導(dǎo)SHBs與ECHS1相互作用在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis b，CHB）患者發(fā)生肝脂肪變中的可能作用。為未來(lái)CHB合并脂肪肝分

2、子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SHBs和pcDNA3.1(+)-ECHS1。
　　2.建立SHBs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型：將 pcDNA3.1(+)-SHBs通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)作為對(duì)照，24h后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran

3、scription polymerase reaction，RT-PCR)法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)SHBs的表達(dá)。
　　3.設(shè)計(jì)并合成針對(duì)ECHS1的siRNA序列插入到pSilencer載體中，通過(guò)脂質(zhì)體將插入ECHS1-siRNA陰性對(duì)照序列的pSilencer、pcDNA3.1(+)-ECHS1、插入了有效ECHS1干擾序列的pSilencer分別轉(zhuǎn)入已成功表達(dá)SHBs基因的HepG2細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載

4、質(zhì)粒HepG2細(xì)胞和單純轉(zhuǎn)染SHBs的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照。
　　4.轉(zhuǎn)染后48h用半定量RT-PCR和Western Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè) ECHS1及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，并測(cè)定各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)氨酶水平和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）的含量，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立He

5、pG2細(xì)胞SHBs的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型
　　2.與未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞相比，單純SHBs轉(zhuǎn)染組及SHBs+ECHS1-siRNA陰性序列對(duì)照組在核酸水平ECHS1、LPL、ApoA1表達(dá)分別下降，ACC表達(dá)升高，PPARα和CPT1A表達(dá)無(wú)明顯變化，蛋白水平的上述基因的表達(dá)趨勢(shì)同核酸基本一致，細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶升高，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量升高，甘油三酯含量下降。
　　3.相比單純SHBs轉(zhuǎn)染組：在轉(zhuǎn)染了SHBs的HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)E

6、CHS1可在核酸和蛋白水平上調(diào)LPL的表達(dá)（P<0.05），下調(diào)ApoA1、ACC和CPT1A的表達(dá)(P<0.05)，而對(duì)PPARα的表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；且細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶水平、細(xì)胞內(nèi)TC及TG含量均下降。
　　4.相比單純 SHBs轉(zhuǎn)染組：在轉(zhuǎn)染了 SHBs的HepG2細(xì)胞中靶向下調(diào)ECHS1可在核酸水平下調(diào)LPL和ApoA1，上調(diào)ACC、CPT1A表達(dá)，但ApoA1表達(dá)要高于ECHS1過(guò)表達(dá)組，而PPARα表達(dá)無(wú)明顯