安絲菌素后修飾及安莎類抗生素聚酮鏈的釋放.pdf

1、安絲菌素(Ansamitocins)是19元大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物,屬于Ⅰ型聚酮類安莎霉素(ansamycins),對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有顯著的抑制活性。該化合物生物合成機(jī)制和復(fù)雜的后修飾反應(yīng)已經(jīng)得到了深入的研究。本文主要對(duì)安絲菌素生物合成后修飾中的D-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)以及安莎類抗生素聚酮鏈釋放與環(huán)化機(jī)制兩個(gè)方面開(kāi)展了相應(yīng)的工作。
　　 第一部分的研究?jī)?nèi)容主要是關(guān)于O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)后修飾順序。通過(guò)基因缺失與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定

2、了基因asm7編碼的蛋白是負(fù)責(zé)安絲菌素C-20位羥基的甲基化?；騛sm7突變株在液體和固體YMG培養(yǎng)基中分別產(chǎn)生了20-氧,氮.二去甲基安絲菌素P-3和20-氧—去甲基安絲菌素P-3,并通過(guò)核磁共振進(jìn)行了相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。生物信息學(xué)分析顯示Asm7屬于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴的Ⅱ型甲基轉(zhuǎn)移酶家族。利用大腸桿菌異源表達(dá)的Asm7天然活性蛋白以二聚體的形式存在,單體的分子量大小為41 kDa。通過(guò)相應(yīng)突變株的大量發(fā)酵得到了需要的

3、底物,并以SAM和19-氯代原安絲菌素為底物,確定了Asm7的最適反應(yīng)溫度為35℃,最適pH為8.0,最佳金屬離子為5 mM的MgCl2。另外,通過(guò)比較Asm7對(duì)原安絲菌素、19-氯代原安絲菌素和20-氧,氮—二去甲基—脫氧美登木醇三種底物的體外酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)差異的分析,確定了O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Asm7)在安絲菌素后修飾中的確切催化順序。
　　 第二部分是關(guān)于安莎類抗生素聚酮鏈釋放與環(huán)化。從生物合成角度分析,安莎類抗生素由Ⅰ型聚酮

4、合酶催化形成。在典型的Ⅰ型聚酮合酶的C末端存在一個(gè)屬于α/β水解酶超家族的硫酯酶TE結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)催化分子內(nèi)或分子外的親核反應(yīng)實(shí)現(xiàn)聚酮鏈的釋放。前期研究發(fā)現(xiàn),安莎類抗生素生物合成基因簇中負(fù)責(zé)聚酮鏈釋放的蛋白是由芳胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的酰胺合酶基因編碼,與硫酯酶有較大的差異,代表著一類新穎的聚酮鏈釋放和成環(huán)機(jī)制。本論文采用安絲菌素、萘霉素、利福霉素、格爾登素等產(chǎn)生菌為研究材料開(kāi)展了相應(yīng)的工作。首先,利用體內(nèi)基因突變與互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酰胺合酶基

5、因?qū)τ诎采惢衔锖铣傻谋匾?同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了安莎類抗生素之間的酰胺合酶基因沒(méi)有功能互補(bǔ)性;其次,通過(guò)末端ACP的置換實(shí)驗(yàn)以及細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)考查了末端ACP與酰胺合酶之間的關(guān)系;最后,為了進(jìn)一步的明確酰胺合酶的催化機(jī)制,利用大腸桿菌作為表達(dá)宿主對(duì)其的進(jìn)行了異源表達(dá)。接下來(lái)將會(huì)利用化學(xué)合成底物進(jìn)行體外酶催化分析、定點(diǎn)突變確定其關(guān)鍵氨基酸特征,以及考察酰胺合酶和聚酮模塊末端酰基載體蛋白之間的關(guān)系等方面工作,一來(lái)闡明酰胺合酶對(duì)安莎類抗生素釋放和