P物質(zhì)對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系的作用效果觀察.pdf

1、各種原因造成的臨床大段骨缺損以及骨不連的修復(fù)問(wèn)題,都是骨科學(xué)術(shù)界一直以來(lái)研究的熱點(diǎn)以及難點(diǎn)。目前臨床上通常采用的處理辦法包括自體骨移植和異體骨移植,然而其相關(guān)技術(shù)均不同程度地存在一些不足,故而無(wú)法達(dá)到臨床的實(shí)際應(yīng)用需求。隨著骨組織工程領(lǐng)域不斷深入的研究,其為臨床骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法。組織工程骨材料復(fù)合種子細(xì)胞以及神經(jīng)因子應(yīng)用于大段骨缺損修復(fù),具有良好的可塑性以及成骨效應(yīng),臨床應(yīng)用備受期待。
　　骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理

2、過(guò)程,涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用。生長(zhǎng)因子作為人體組織和器官發(fā)生、發(fā)育以及成熟的重要物質(zhì),為骨缺損修復(fù)提供最基本的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ),而神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)骨代謝的影響作用尤為突出。P物質(zhì)(substance P,SP)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽遞質(zhì),已經(jīng)證實(shí)SP神經(jīng)肽來(lái)源于感覺(jué)神經(jīng)纖維,可作用于成骨細(xì)胞,且貫穿于骨折愈合的整個(gè)過(guò)程。然而目前的實(shí)驗(yàn)研究存在分歧,SP對(duì)骨代謝成骨細(xì)胞的作用效果尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí),成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞體外聯(lián)合共培養(yǎng)體

3、系,可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖以及組織工程骨的血管化再生進(jìn)程,有助于增強(qiáng)組織工程骨對(duì)骨缺損的修復(fù)。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)源性內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)與成骨細(xì)胞(OB)體外聯(lián)合培養(yǎng)體系,觀察SP對(duì)此共培養(yǎng)細(xì)胞體系的最適濃度以及作用效果,明確SP對(duì)內(nèi)皮與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系功能的影響,探索SP在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用前景。
　　目的:
　　觀察P物質(zhì)(substance P,SP)在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)源性內(nèi)皮細(xì)

4、胞(ECs)與成骨細(xì)胞(OB)體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度;以及其對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)的作用,為應(yīng)用SP促進(jìn)組織工程骨修復(fù)骨缺損提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法:
　　第一部分:P物質(zhì)在BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度
　　采用新生新西蘭大白兔胎兔(雌雄不限)密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞行體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代,獲得較純的BMSCs。連續(xù)傳代后第3代BMSCs進(jìn)行分化誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞以

5、及成骨細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)定性檢測(cè)鑒定。兩種細(xì)胞誘導(dǎo)7d后,將其按照1:2比例直接混合培養(yǎng),待細(xì)胞傳至第2代后,加入1×10-12-1×10-6 mol/L不同濃度的SP作為實(shí)驗(yàn)組,以正常未加SP的細(xì)胞培養(yǎng)基為對(duì)照組。培養(yǎng)后1、3、5、7d采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性,并用sigma-plot軟件生成生長(zhǎng)曲線,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量,測(cè)定堿性磷酸酶活性及骨鈣素表達(dá)量。
　　第二部分:P物質(zhì)對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體

6、系的作用效果觀察
　　分別建立BMSCs源性內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)與成骨細(xì)胞(OB)單獨(dú)培養(yǎng),或按1:2的比例體外直接或間接共培養(yǎng)體系,細(xì)胞內(nèi)同時(shí)加入1×10-8 mol/L SP。培養(yǎng)48小時(shí)后采用流式細(xì)胞周期分析細(xì)胞增殖與活性,并分別采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR(rt-PCR)檢測(cè)骨鈣素(OC)mRNA基因的表達(dá)。以不添加SP的細(xì)胞培養(yǎng)體系作為對(duì)照組,比較加入SP時(shí)各組細(xì)胞功能的變化。

7、
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　CCK-8曲線圖可以直觀的看出1d時(shí)除低濃度組1×10-12mol/L作用效果不明顯外,其余SP濃度組作用效果明顯;3d以后SP各濃度組對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞均具有促進(jìn)作用且隨著時(shí)間的推移作用效果呈現(xiàn)增長(zhǎng),而SP濃度組1×10-8mol/L時(shí)細(xì)胞的促進(jìn)增殖效果最明顯,組間比較效果顯著,細(xì)胞增生活躍。堿性磷酸酶ALP活性表達(dá)結(jié)果提示3d以后SP作用效果明顯,低濃度組1×10-12 mol/L作用效

8、果不明顯,而1×10-8-1×10-6mol/L作用效果明顯。骨鈣素(BGP)的表達(dá)檢測(cè)中3d以后各濃度SP實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照均有所提高,而在1×10-8 mol/L的SP濃度組作用效果最明顯,且在1×10-8 mol/L濃度組相較于其他SP實(shí)驗(yàn)組也具有顯著性差異。
　　第二部分:
　　較OB單獨(dú)培養(yǎng),間接共培養(yǎng)時(shí)流式細(xì)胞周期檢測(cè)表現(xiàn)為G1期明顯減少,S期阻滯(P<0.05);ALP的表達(dá)有所提高(P<0.05);OC mRN

9、A的表達(dá)則顯著性升高(P<0.001)。較OB單獨(dú)培養(yǎng),直接共培養(yǎng)時(shí)ALP和OC mRNA的表達(dá)均顯著性升高(P<0.001)。在促進(jìn)ALP和OC mRNA的表達(dá)上,直接共培養(yǎng)較間接共培養(yǎng)均有所提高(P<0.05)。加入SP后,實(shí)驗(yàn)組OB單獨(dú)培養(yǎng)相較對(duì)照組OB單獨(dú)培養(yǎng),流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示細(xì)胞阻滯于G2/M期,G1期明顯減少(P<0.05);ALP活性有所升高,OC的mRNA的表達(dá)水平也有所提高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)細(xì)胞較對(duì)照組

10、共培養(yǎng)細(xì)胞,流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示G1期明顯減少(P<0.001),細(xì)胞阻滯于G2/M及S期;ALP的表達(dá)有所上升,OC的mRNA的表達(dá)水平有所提高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　在體外內(nèi)皮與成骨細(xì)胞聯(lián)合共培養(yǎng)中,SP對(duì)新種子細(xì)胞促進(jìn)效果明顯,其在1×10-8mol/L對(duì)聯(lián)合共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖和活性作用最強(qiáng)。BMSCs源性內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞相容性良好,SP可促進(jìn)OB的活性,并且可顯著促進(jìn)共培養(yǎng)體系中OB的增