弓形蟲(chóng)GRA4、GRA7、GRA20、ROP20的序列分析及GRA4、GRA7重組乳酸菌的免疫效果.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是能夠感染所有溫血?jiǎng)游锏臋C(jī)會(huì)性致病寄生蟲(chóng)，它寄生于機(jī)體的有核細(xì)胞內(nèi)從而引發(fā)弓形蟲(chóng)?。═oxoplasmosis）。該寄生蟲(chóng)主要通過(guò)污染的食物和水感染宿主，同時(shí)也存在垂直傳播，通過(guò)母嬰傳播的方式來(lái)感染子代，孕婦若感染弓形蟲(chóng)可能導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、畸形或者死胎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約三分之一的人口感染過(guò)弓形蟲(chóng)，并且其對(duì)畜牧業(yè)的影響也非常重大，因此在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上均受到廣泛重視，但是目前并沒(méi)有有效的藥物能夠根

2、除弓形蟲(chóng)，因此弓形蟲(chóng)疫苗的研制一直是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一。
　　自然界中廣泛存在的乳酸菌是構(gòu)成益生菌的重要成員之一，它不僅可以抑制人和動(dòng)物腸道有害菌的生長(zhǎng)，還能調(diào)節(jié)菌群的平衡和內(nèi)環(huán)境pH的穩(wěn)定，使機(jī)體保持穩(wěn)定的免疫狀態(tài)。乳酸菌是一類具有佐劑活性的非病原菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，通過(guò)它表達(dá)的外源蛋白可直接隨菌體服下，是目前較為理想的轉(zhuǎn)化和表達(dá)系統(tǒng)，且具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本論文對(duì)弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白4、7、20（GRA4、GRA7、G

3、RA20）和棒狀體蛋白20（ROP20）基因序列的變異做了分析。首先對(duì)不同宿主和地理來(lái)源的蟲(chóng)株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行克隆測(cè)序，然后用Clustal X1.83進(jìn)行序列比對(duì)，最后再用最大相似法（maximum likelihood，ML）、鄰接法（neighbor joining，NJ）和最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：在12株不同蟲(chóng)株當(dāng)中，GRA4和GRA7的基因序列分別為966bp和71

4、2bp，其種內(nèi)變異率分別為0~2.4％和0~2.7%；在16株蟲(chóng)株中，GRA20基因序列為1586bp，種內(nèi)變異率為0~7.9%，當(dāng)去掉Ⅲ型蟲(chóng)株（CTG、VEG）后，種內(nèi)變異率為0~0.7%；在18株不同的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株當(dāng)中，ROP20基因序列為1659bp，種內(nèi)變異率為0~1.4%。通過(guò)構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)顯示，GRA4基因不能較好的反應(yīng)不同蟲(chóng)株間的遺傳變異關(guān)系，GRA7基因能區(qū)分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型蟲(chóng)株，GRA20基因能區(qū)分Ⅰ型和Ⅲ型蟲(chóng)株，ROP20

5、基因能區(qū)分弓形蟲(chóng)Ⅰ型和ToxoDB＃9型蟲(chóng)株。
　　本論文還以乳酸桿菌作為載體來(lái)探討弓形蟲(chóng)GRA4和GRA7在口服免疫方式下的免疫效果。首先根據(jù)ToxoDB網(wǎng)站上收錄GT1型蟲(chóng)株的GRA4和GRA7基因序列用Primers5.0設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)NcoⅠ和XbaⅠ的引物，并在兩個(gè)蛋白的C端引入His標(biāo)簽。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序，得到的GRA4和GRA7序列，并將其分別連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達(dá)載體pSIP-409中，由此成

6、功構(gòu)建重組表達(dá)載體pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7。將重組質(zhì)粒pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7通過(guò)電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入Lb.plantarum NC8中，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定，再用Western-blot分析，成功制備弓形蟲(chóng)GRA4和GRA7重組乳酸菌后，再將其免疫小鼠。首先將小鼠分為空白組、空白奶粉組和Nc8-pSIP-409乳酸桿菌空載體組三個(gè)對(duì)照組以及Nc8-409-GRA4和Nc8-40

7、9-GRA7重組乳酸桿菌組兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以口服的方式來(lái)免疫小鼠。免疫程序?yàn)槊恐苓B續(xù)口服三天，每次每只小鼠灌服1.0×109cfu/200μL，連免兩周后間隔一周，再加強(qiáng)免疫兩次。待免疫結(jié)束后，測(cè)定相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)，并在一免后42d，用強(qiáng)毒株RH速殖子（103個(gè)/只）通過(guò)腹腔接種感染小鼠，記錄每組小鼠存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：弓形蟲(chóng)GRA7重組乳酸菌疫苗在對(duì)小鼠口服免疫后其機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生較高水平的IgG和IgG2a以及IFN-γ，并

8、產(chǎn)生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8-T細(xì)胞，能夠有效地產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，而GRA4重組乳酸菌疫苗的免疫原性較弱。在對(duì)小鼠腹腔注射弓形蟲(chóng)RH速殖子后，對(duì)照組小鼠的平均存活時(shí)間為6.1d，NC8-409-GRA7組小鼠的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)至6.8d，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而NC8-409-GRA4組小鼠的平均存活時(shí)間與對(duì)照組相比未延長(zhǎng)。
　　本實(shí)驗(yàn)首次將弓形蟲(chóng)GRA4、GRA7與乳酸菌重組進(jìn)行口服免疫，