端粒長(zhǎng)度在衰老人腎小球系膜細(xì)胞中的變化及JAK-STAT通路對(duì)其的影響.pdf

1、目的：衰老是生物界的普遍現(xiàn)象,腎臟是人體出現(xiàn)老化比較明顯的臟器,其衰老對(duì)機(jī)體的影響尤為重要。我國(guó)65歲以上人口已經(jīng)超過(guò)1億,具有世界上最為龐大的老年人群,更為嚴(yán)峻的是慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率逐年上升,特別是老年人群CKD發(fā)病率明顯升高,老年腎臟疾病正逐漸成為影響國(guó)民健康和社會(huì)發(fā)展的主要疾病[1,2,3]。研究腎臟衰老機(jī)制、保護(hù)衰老腎臟功能是國(guó)家、社會(huì)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大需求,是關(guān)系到我國(guó)未來(lái)國(guó)民健康的重大課題。目前關(guān)于腎臟衰老的機(jī)制還不明

2、確,腎小球系膜細(xì)胞(GMC)作為腎臟最重要的固有細(xì)胞,其表型和功能的改變?cè)谀I臟衰老進(jìn)程中必然發(fā)揮著重要的作用。研究GMC的表型和功能隨衰老發(fā)生的改變及其發(fā)生機(jī)制有助于揭示腎臟衰老的機(jī)制。
　　 細(xì)胞衰老的最重要的機(jī)制之一就是端粒長(zhǎng)度的變化。端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端的DNA重復(fù)序列,在染色體兩端與核蛋白結(jié)合成復(fù)合物,它能阻止染色體末端被消化和降解,有著保護(hù)和穩(wěn)定染色體的作用,但是端粒長(zhǎng)度隨著細(xì)胞的分裂而縮短,就會(huì)失去保護(hù)染色體

3、的作用,染色體變得不穩(wěn)定并發(fā)生重排、非整倍性變化等畸變,導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制性衰老而死亡,但是同一個(gè)細(xì)胞系的不同細(xì)胞的分裂增殖能力具有很大的差異,這種現(xiàn)象說(shuō)明端?？s短具有隨機(jī)性,而氧化應(yīng)激可能通過(guò)損傷端粒DNA而加速端?？s短,從而加快細(xì)胞衰老。本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn):30.0mmolL-1葡萄糖、10-6molL-1血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于人腎小球系膜細(xì)胞(HGMC)96h,可以造成細(xì)胞增殖能力下降,β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率增多等衰老

4、表現(xiàn),高糖和AngⅡ是否能加速HGMC端粒的縮短而促進(jìn)衰老,值得進(jìn)一步研究。
　　 近年來(lái),大量實(shí)驗(yàn)證明信號(hào)通路在調(diào)控衰老的起始和持續(xù)中起著重要的作用。JAK/STAT途徑是一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn):高糖、AngⅡ刺激HGMC發(fā)生衰老時(shí),細(xì)胞內(nèi)STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)升高,說(shuō)明JAK/STAT通路參與了HGMC的衰老,那么

5、JAK/STAT通路參與HGMC衰老的具體機(jī)制,是否通過(guò)影響端粒長(zhǎng)度而影響衰老,值得進(jìn)一步深入研究。
　　 方法：
　　 一、端粒長(zhǎng)度在衰老人腎小球系膜細(xì)胞中的變化：采用高糖和AngⅡ作為誘導(dǎo)HGMC衰老的刺激因素建立HGMC衰老模型,細(xì)胞同步化后分為:正常對(duì)照組(不含任何刺激因素)、高糖濃度組(葡萄糖:30.0mmolL-1)、AngⅡ組(AngⅡ:10-6molL-1),培養(yǎng)96h后收集細(xì)胞。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),

6、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,并檢測(cè)細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率,來(lái)判斷衰老細(xì)胞模型是否成功建立,然后用Southern blot法檢測(cè)各組細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的變化。
　　 二、JAK/STAT通路對(duì)衰老人腎小球系膜細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的影響：采用高糖和AngⅡ作為誘導(dǎo)HGMC衰老的刺激因素建立HGMC衰老模型,細(xì)胞同步化后分為:正常對(duì)照組:高糖濃度組(葡萄糖:30.0mmolL-1);AngⅡ組(AngⅡ:10-6molL-1);高糖+Ag49

7、0組(Ag490:10.0umolL-1);AngⅡ+Ag490組(Ag490:10.0μmolL-1);各組細(xì)胞培養(yǎng)到96 h。Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白,P53、P21和PRB蛋白的表達(dá)變化,Southern blot法檢測(cè)各組細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的變化。
　　 三、普羅布考、氯沙坦對(duì)衰老人腎小球系膜細(xì)胞Jak/STAT通路和端粒長(zhǎng)度的影響：將普羅布考、氯沙坦提前

8、加入HGMC培養(yǎng)液中,分別在高糖和AngⅡ作用條件下培養(yǎng),應(yīng)用Southern bolt法檢測(cè)端粒長(zhǎng)度的變化,Westetn blot檢測(cè)STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)、并檢測(cè)細(xì)胞的衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率。
　　 (一)高糖作用組:
　　 實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組；高糖濃度組(葡萄糖:30.0mmolL-1)；高糖+普羅布考組(普羅布考:40.0umolL-1)。
　　 (

9、二)AngⅡ作用組:
　　 實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組；AngⅡ組(AngⅡ:10-6molL-1)；AngⅡ+氯沙坦組(氯沙坦:10-5molL-1)。
　　 結(jié)果：
　　 一、端粒長(zhǎng)度在衰老人腎小球系膜細(xì)胞中的變化光鏡下觀察:正常對(duì)照組細(xì)胞呈條梭形生長(zhǎng),排列規(guī)則,細(xì)胞邊界清晰。與正常組細(xì)胞相比,高糖組和AngⅡ組細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞體積變大,胞漿區(qū)域增大,胞漿中可見(jiàn)較多顆粒或空泡,邊界模糊,形成致密單層細(xì)胞時(shí)間延長(zhǎng)

10、,數(shù)目減少。流式細(xì)胞儀分析顯示:正常對(duì)照組細(xì)胞的各期比例正常,G0-G1期細(xì)胞比率為50.23±3.23％,而高糖組和AngⅡ組大部分細(xì)胞停滯于G0-G1期,S期及G2/M期則趨于消失,高糖組G0-G1期細(xì)胞比率為91.16±5.46％,AngⅡ組G0-G1期細(xì)胞比率為89.57±4.13％,比正常對(duì)照組明顯增加,差異有顯著性(P＜0.05)。高糖組和AngⅡ組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率分別為65.62±6.56％和45.95±2.0

11、3％,比正常對(duì)照組24.11±4.71％明顯增加,差異有顯著性(P＜0.05)。正常對(duì)照組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為8.14±1.12kb,高糖組和AngⅡ組細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比對(duì)照組明顯縮短,分別為3.91±0.77kb和4.15±0.58kb,差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 二、JAK/STAT通路對(duì)衰老人腎小球系膜細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的影響：HGMC內(nèi)STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)在高糖和AngⅡ組比正常對(duì)

12、照組均明顯升高,而高糖+Ag490組比高糖組明顯減低,AngⅡ+Ag490組比AngⅡ組明顯減低(P＜0.05)。正常對(duì)照組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為7.11±1.12 kb,高糖組和AngⅡ組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度比對(duì)照組明顯的縮短,分別為3.90±0.72kb和4.15±0.81kb。高糖+Ag490組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為5.05±0.92kb,比高糖組明顯延長(zhǎng),AngⅡ+Ag490組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為5.13±1.28kb,比AngⅡ組明顯延長(zhǎng)(

13、P＜0.05)。HGMC內(nèi)P53、P21和PRB蛋白在正常對(duì)照組僅有少量表達(dá),在高糖和AngⅡ組均明顯升高,而高糖+Ag490組比高糖組明顯減低,AngⅡ+Ag490組比AngⅡ組明顯減低(P＜0.05)。
　　 三、普羅布考、氯沙坦對(duì)衰老人腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT通路和端粒長(zhǎng)度的影響：正常對(duì)照組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為4.82±1.21kb,高糖組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為3.26±0.34kb,比對(duì)照組明顯的縮短,普羅布考組細(xì)胞平均

14、端粒長(zhǎng)度為3.91±0.18 kb,比高糖組明顯延長(zhǎng),但仍小于正常對(duì)照組。高糖組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率為60.66±4.76％,比正常對(duì)照組16.71±4.21％明顯增加,普羅布考組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率為29.6±3.23％,較高糖組明顯降低。普羅布考組細(xì)胞內(nèi)STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)均比高糖組有所下降。
　　 AngⅡ組細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度為3.35±1.03kb,比對(duì)照組5.62

15、±1.47kb明顯縮短,氯沙坦組平均細(xì)胞端粒長(zhǎng)度為4.31±0.22kb,比AngⅡ組延長(zhǎng),但仍小于正常對(duì)照組。AngⅡ組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率為60.66±4.76％,比正常對(duì)照組16.71±4.21％明顯增加,氯沙坦組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率為27.3±3.18％,比AngⅡ組增加。氯沙坦組細(xì)胞STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)均比AngⅡ組有所下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、高

16、糖、AngⅡ在體外能促進(jìn)HGMC的端粒長(zhǎng)度縮短。
　　 2、高糖、AngⅡ能誘導(dǎo)衰老的HGMC中的STAT1、STAT3磷酸化增加。在高糖、AngⅡ誘導(dǎo)衰老的HGMC中,阻斷JAK/STAT通路后端粒長(zhǎng)度縮短明顯減輕,P53、P21和PRB蛋白表達(dá)下降,細(xì)胞衰老減輕。
　　 3、普羅布考、氯沙坦分別能減輕高糖和AngⅡ加速的HGMC端粒縮短,降低STAT1、STAT、P-STAT1、P-STAT3蛋白的表達(dá),從而減輕HG