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文檔簡介
1、研究背景與目的:
大腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。在北美、歐洲各國,大腸癌占全部癌癥死亡因?yàn)榈牡?位。在我國,隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,生活方式和飲食習(xí)慣的改變,大腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。目前對大腸癌的治療采取的是一種包括手術(shù)、放療、化療以及生物、免疫治療等在內(nèi)的綜合治療,但不管采用哪種手段,大腸癌的總體治愈率仍徘徊在50%左右,長期生存率和生活質(zhì)量仍不理想。因而,大腸癌的化學(xué)預(yù)防逐漸成為
2、近年來研究的焦點(diǎn)。化學(xué)預(yù)防是應(yīng)用天然產(chǎn)物和(或)人工合成的化學(xué)物質(zhì)來逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。大腸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多步驟的過程,是環(huán)境因素與機(jī)體遺傳因素相互作用的結(jié)果。正常腸粘膜上皮細(xì)胞演變?yōu)榘┘?xì)胞的歷程有數(shù)十年,這就為化學(xué)預(yù)防提供了良好的干預(yù)時機(jī)。目前通過膳食中存在的天然抗癌成分來防癌是最有希望和潛力的腫瘤防治方法。天然化學(xué)預(yù)防藥物與人工合成的化學(xué)物質(zhì)相比,更具安全性和實(shí)用性,也更易為人體所接受。
3、 流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)常食用辣根、甘藍(lán)、花椰菜、卷心菜等十字花科蔬菜能降低人類前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌和結(jié)腸癌等的患病危險。芥菜籽(mustard seed,MS)是十字花科蕓苔屬植物芥菜的種子,其加工的產(chǎn)品芥末油和芥未粉是我們生活中常用的調(diào)味品?!吨袊幍洹酚涊d:芥菜籽性溫,味辛,歸肺、胃經(jīng)。功擅溫中散寒、豁痰利竅、通絡(luò)消腫,常用于治療寒痰喘咳、胸脅脹痛、肢體麻木、關(guān)節(jié)疼痛、陰疽腫毒等疾病。近年來有研究發(fā)現(xiàn),芥菜籽及其活性提
4、取物都具有抗癌防癌的活性。在二甲基苯并蒽(DMBA)誘發(fā)小鼠腫瘤模型中,芥菜籽油能夠降低DMBA經(jīng)胎盤和哺乳的致癌性,實(shí)驗(yàn)組妊娠小鼠給予芥菜籽油,子代小鼠腫瘤發(fā)生率16%,對照組妊娠小鼠給予玉米油,子代小鼠腫瘤發(fā)生率為70%。芥菜籽的醇提取物在DMBA誘發(fā)瑞士白化小鼠皮膚癌模型中,能使實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤發(fā)生率下降50%。Gagandeep等報道在苯并芘[B(a)P]誘導(dǎo)小鼠胃癌和甲基膽蒽(MCA)誘導(dǎo)小鼠宮頸癌模型中,實(shí)驗(yàn)組給予含5%芥菜籽
5、的飼料,對照組為標(biāo)準(zhǔn)飼料,結(jié)果實(shí)驗(yàn)組胃癌發(fā)生率降低28%,宮頸癌發(fā)生率降低60%。芥菜籽能否作為一種化學(xué)預(yù)防劑應(yīng)用于大腸癌的預(yù)防,目前這方面的研究不多,同時芥菜籽抗癌的作用機(jī)制還不清楚。
近年來自由基與腫瘤關(guān)系的研究日益受到重視。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),自由基不僅損傷細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變,在致癌和促癌過程中也起重要的作用。自由基是具有不配對電子的原子、原子團(tuán)、分子或離子,對正常生命活動的許多重要反應(yīng)必不可少,它參與多種生物活
6、性物質(zhì)的合成、解毒反應(yīng)、吞噬細(xì)胞殺滅細(xì)菌等過程。但是當(dāng)外界有毒的物理化學(xué)因素如放射線、毒物、化學(xué)致癌物等作用于機(jī)體后,自由基的產(chǎn)生與清除平衡嚴(yán)重失調(diào),則會導(dǎo)致廣泛的損傷效應(yīng)。自由基能引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,改變蛋白質(zhì)、酶的活性,損傷線粒體,攻擊DNA,誘發(fā)基因突變。生物機(jī)體主要通過自由基清除酶來防止自由基損傷,目前已知生物體內(nèi)的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等,它們可分別
7、作用于自由基鏈鎖反應(yīng)的不同環(huán)節(jié),在體內(nèi)擔(dān)負(fù)著清除自由基的重要任務(wù)。SOD是清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基(O2-·)的重要生物酶,它可以催化O2-·的歧化反應(yīng),產(chǎn)生活性相對較低的過氧化氫(H2O2),CAT的主要作用是催化H2O2,GSH-Px能夠清除H2O2及脂類氫過氧化物。脂質(zhì)過氧化是自由基引起細(xì)胞損傷的主要途徑,丙二醛(MDA)是其主要終末產(chǎn)物。通常用MDA的水平來反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)和機(jī)體受損傷的程度。上述指標(biāo)可以綜合反應(yīng)機(jī)體
8、內(nèi)過氧化的程度和抗自由基氧化的能力。
動物腫瘤模型是目前研究腫瘤病因、預(yù)防、早期診斷和治療的重要工具。大腸癌常用的動物模型是化學(xué)致癌,其中研究最多和應(yīng)用最廣泛的大腸特異性致癌物是二甲基肼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)。AOM是DMH的代謝中間產(chǎn)物,具有比DMH更強(qiáng)的致癌性和化學(xué)穩(wěn)定性。它是一種強(qiáng)氧化劑,可導(dǎo)致細(xì)胞膜以及DNA過氧化損傷,引起基因突變,從而使細(xì)胞過度增殖,形成特異性的大腸腫瘤。AOM誘導(dǎo)小鼠大腸癌的發(fā)生是
9、一個長期的多階段的過程,與人類大腸癌發(fā)生過程中細(xì)胞動力學(xué)、病理組織學(xué)和分子特征方面的變化特點(diǎn)非常相似。
基于以上研究背景,本實(shí)驗(yàn)以氧化偶氮甲烷(AOM)化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤為研究對象,初步研究芥菜籽對AOM化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤的預(yù)防作用,免疫組化檢測小鼠大腸腫瘤組織的增殖和凋亡情況;觀察芥菜籽對小鼠體內(nèi)氧自由基水平和抗氧化酶活性的影響,從自由基反應(yīng)與腫瘤發(fā)生的角度探討芥菜籽預(yù)防大腸癌發(fā)生的作用機(jī)制,為芥菜籽應(yīng)用于大腸癌
10、的化學(xué)預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
材料和方法
1、選取60只昆明種雌性小鼠(體重18~20 g)為實(shí)驗(yàn)對象,隨機(jī)均分為AOM模型組、AOM+5%MS干預(yù)組、AOM+10%MS干預(yù)組和正常對照組。小鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg.wt),每周1次,連續(xù)3周,建立大腸癌動物模型;
2、觀察各組小鼠的一般狀態(tài),如攝食及飲水情況、營養(yǎng)狀況、體重、活動狀態(tài)、毛色、光澤度變化、大便性狀等方面的改變情況
11、。實(shí)驗(yàn)36周時處死小鼠,留取血清,分離大腸,預(yù)冷生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物;
3、觀察記錄各組小鼠腫瘤發(fā)生的部位、數(shù)目和大小,計算各組小鼠腫瘤發(fā)生率、平均腫瘤數(shù)和抑瘤率,同時觀察其它臟器有無轉(zhuǎn)移灶發(fā)生;
4、腫瘤組織常規(guī)固定脫水,石蠟包埋切片,H.E染色觀察,確定腫瘤的組織學(xué)類型;
5、免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中PCNA蛋白的表達(dá)水平,計算腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)(PI);
6、TUNEL染
12、色檢測腫瘤組織凋亡情況,計算腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI);
7、比色法檢測各組小鼠血清中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)的活力和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平。
結(jié)果
1.實(shí)驗(yàn)終末期,AOM模型組小鼠出現(xiàn)消瘦衰竭、厭食、脫毛、血便等表現(xiàn),其中有2只小鼠伴有腹水。AOM模型組小鼠體重較正常對照組顯著降低(P<0.05),MS干預(yù)組小鼠體重較AOM模型組增加(P<0.05),而MS干預(yù)組之
13、間的小鼠體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。
2.正常對照組小鼠無腫瘤發(fā)生,AOM模型組小鼠腫瘤發(fā)生率為86.7%(13/15),5%MS干預(yù)組腫瘤發(fā)生率為60.0%(9/15),10%MS干預(yù)組腫瘤發(fā)生率為41.7%(5/12)。三組小鼠腫瘤發(fā)生率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=6.607,P=0.048)。
3.AOM模型組小鼠平均腫瘤數(shù)為2.20±1.21個,而5%MS干預(yù)組小鼠平均腫瘤數(shù)減少為1.07±1
14、.10個(P<0.05,與模型組相比),抑瘤率為51.4%;10%MS干預(yù)組小鼠平均腫瘤數(shù)減少為0.67±0.89個(P<0.05,與模型組相比),抑瘤率達(dá)69.5%。
4.AOM模型組、5%MS和10%MS干預(yù)組腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)分別為:59.9±4.4、41.7±4.9和32.0±3.9,其中10%MS干預(yù)組腫瘤細(xì)胞的PI明顯低于AOM模型組和5%MS干預(yù)組,差異具有顯著性(P<0.05)。
5.A
15、OM模型組、5%MS和10%MS干預(yù)組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)分別為:6.9±1.4、9.3±1.5和15.0±2.4,其中10%MS干預(yù)組腫瘤細(xì)胞的AI明顯高于AOM模型組和5%MS干預(yù)組,差異具有顯著性(P<0.05)。
6.AOM模型組小鼠血清抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX的活力明顯低于正常對照組,差異具有顯著性(P<0.05);MS干預(yù)組小鼠血清SOD、CAT、GSH-PX的活力與AOM模型組相比均有所提高,
16、具有顯著性差異(P<0.05);其中10%MS干預(yù)組增加小鼠血清抗氧化酶活力的作用最明顯,與5%MS干預(yù)組相比差異具有顯著性(P<0.05)。
7.AOM模型組小鼠血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)的含量明顯高于正常對照組,差異具有顯著性(P<0.05);MS干預(yù)組小鼠血清MDA的含量與AOM模型組相比均有所下降,具有顯著性差異(P<0.05);其中10%MS干預(yù)組降低小鼠血清MDA的效果最明顯,與5%MS干預(yù)組相比差異具有顯著
17、性(P<0.05)。
結(jié)論
1.芥菜籽對AOM誘導(dǎo)的小鼠大腸腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用,能明顯降低AOM誘導(dǎo)的小鼠大腸癌發(fā)生率和減少小鼠的平均腫瘤數(shù)。隨著芥菜籽濃度的增加,其預(yù)防大腸癌發(fā)生的作用增強(qiáng)。
2.芥菜籽能降低小鼠大腸腫瘤組織中PCNA的表達(dá)水平,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
3.在AOM誘導(dǎo)腫瘤過程中,芥菜籽能提高小鼠血清中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX的活性,降
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