維持體外擴(kuò)增臍帶血干細(xì)胞干性-下調(diào)異常升高的ROS和p38MAPKα信號.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、細(xì)胞內(nèi)ROS 對臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響
　　 目的：使用抗氧化劑NAC 調(diào)節(jié)體外擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，評估ROS 對臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：建立臍帶血CD133+細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系，CD133+細(xì)胞培養(yǎng)過程中分別采用不同濃度的抗氧化劑NAC 清除細(xì)胞內(nèi)ROS，檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，并通過CD13

2、3+細(xì)胞亞群變化、CFU 及CAFC 評估擴(kuò)增后細(xì)胞功能。同時(shí)檢測擴(kuò)增后細(xì)胞增殖(CFSE)、細(xì)胞凋亡、衰老表型及相關(guān)基因p16INK4和 p21WAF1的表達(dá)，探討ROS作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中胞內(nèi)ROS 升高，并伴隨著HSC 自我更新能力損傷?？寡趸瘎㎞AC 可以有效清除胞內(nèi)ROS，并且清除程度與藥物劑量呈正相關(guān)。其中低劑量處理組(0.1mmol/L)的CD133+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、產(chǎn)生CFU

3、細(xì)胞密度、CAFC 形成能力均高于對照組（p<0.05）。NAC 高劑量組(1.0mmol/L)CD133+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)低于對照組（p<0.01），但CFU 及CAFC 形成能力強(qiáng)于對照組（p<0.01）。
　　 NAC 可以明顯抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。高劑量的NAC 抑制細(xì)胞增殖水平。
　　 結(jié)論：ROS 參與調(diào)節(jié)CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增，適當(dāng)?shù)慕档蚏OS 可促進(jìn)擴(kuò)增細(xì)胞干性的維持，過度清除ROS

4、則抑制細(xì)胞增殖。ROS 主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及衰老途徑發(fā)揮作用。
　　 第二部分、抑制活化的p38 MAPKα促進(jìn)臍帶血造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增
　　 目的：應(yīng)用p38MAPKα抑制劑及NOD/SCID 小鼠人造血干細(xì)胞移植模型評估p38MAPKα對臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：建立臍帶血CD133+細(xì)胞無血清無基質(zhì)培養(yǎng)體系，CD133+細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用p38MA

5、PKα抑制劑阻斷p38MAPKα活化，檢測不同時(shí)間點(diǎn)及不同處理組細(xì)胞內(nèi)p38MAPK 活性，并通過CD133+細(xì)胞亞群變化、CFU、CAFC、細(xì)胞遷移率及CXCR4表達(dá)水平評估擴(kuò)增后細(xì)胞特性，運(yùn)用NOD/SCID 小鼠人造血干細(xì)胞移植模型評估擴(kuò)增后細(xì)胞長期造血重建能力。同時(shí)檢測擴(kuò)增后細(xì)胞CFSE 增殖、細(xì)胞凋亡、衰老表型及相關(guān)基因p16INK4和 p21WAF1的表達(dá)，探討p38MAPKα作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：細(xì)胞體外擴(kuò)增過程

6、中p38MAPKα被激活，并伴隨著HSC 自我更新能力損傷。p38MAPKα抑制劑抑制p38MAPKα活化后，促進(jìn)了臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增，代表早期干祖細(xì)胞的CD133+細(xì)胞亞群、CD133+CD38-細(xì)胞亞群、CD133+CXCR4+細(xì)胞亞群、CFU-GEMM 及CAFC 相較于對照組均明顯增加（p<0.01）。NOD/SCID 小鼠人造血干細(xì)胞移植模型中，p38MAPKα抑制劑組的移植物植入率及移植物嵌合率均高于對照組（p<

7、0.01）。機(jī)制檢測顯示p38MAPKα抑制劑可以明顯抑制凋亡率、衰老形成、及衰老相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞向髓系祖分化，對細(xì)胞分裂增殖無明顯作用。
　　 結(jié)論：p38MAPKα參與調(diào)節(jié)CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增，抑制p38MAPKα激活可促進(jìn)HSC 擴(kuò)增，并維持HSC 干性。主要通過抑制細(xì)胞凋亡及衰老途徑發(fā)揮作用。
　　 第三部分、ROS與p38MAPKα在臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增中的相互關(guān)系的研究
　　 目

8、的：分別單用或聯(lián)合應(yīng)用p38MAPKα抑制劑SB203580 及抗氧化劑NAC 調(diào)節(jié)體外擴(kuò)增，比較與評估不同作用靶點(diǎn)對臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響，探討ROS與p38MAPK在臍帶血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增中的相互關(guān)系。
　　 方法：分別采用不加藥物、單用p38MAPKα抑制劑SB203580、單用抗氧化劑NAC、聯(lián)合應(yīng)用p38MAPKα抑制劑SB203580 及抗氧化劑NAC 干預(yù)體外擴(kuò)增，監(jiān)測胞內(nèi)ROS 水平及p

9、38MAPK 活化狀態(tài)，通過CD133+細(xì)胞亞群變化、CFU 及CAFC 評估并比較各處理組擴(kuò)增后細(xì)胞特性差異。
　　 結(jié)果：兩藥聯(lián)用下ROS 抑制作用最強(qiáng)，下降到同期對照組的15.3±2.1％，SB203580 處理組為52.0±7.8％，NAC組為63.4±9.0％，SB 抑制效果優(yōu)于NAC。
　　 p38MAPKα抑制劑及抗氧化劑NAC 對p38MAPKα活化均有抑制作用。相對于初始細(xì)胞，SB組擴(kuò)增效率最高，CD1