應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)篩選異丙酚對內(nèi)毒素血癥大鼠有影響的血清蛋白.pdf

1、膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群,膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥.感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡因為之一,盡管抗生素被廣泛應(yīng)用,并且有重癥監(jiān)護(hù)的支持,死亡率仍高達(dá)35～60％。統(tǒng)計表明,臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negtive bacteria)引起的,在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或稱為內(nèi)毒素(endotoxin),被認(rèn)為是革蘭

2、氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。細(xì)菌破裂時,LPS被釋放出來,廣泛作用于機體多組織器官,其中內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞,在LPS的刺激下,它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokin storm),進(jìn)而引起失控性的炎癥級聯(lián)反應(yīng),包括出血、白細(xì)胞侵潤、血管擴張和血漿蛋白滲出、水腫等,導(dǎo)致微循環(huán)障礙、有效循環(huán)血量減少,最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙。
　　 異丙酚(propof

3、ol)又名得普利麻,化學(xué)名稱2,6二丙基苯酚,是一種惰性的酚類衍生物,在靜脈麻醉中以起效快、時效短、蘇醒早,而在臨床廣泛推廣應(yīng)用。異丙酚現(xiàn)已廣泛用于膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷等重危病人及ICU有監(jiān)測條件下的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年有大量研究表明異丙酚可有效控制創(chuàng)傷、外科手術(shù)等過程中LPS引起的炎癥反應(yīng),其在臨床應(yīng)用中的控制LPS引起的炎癥反應(yīng)作用越來越引起關(guān)注。研究表明異丙酚可能通過a、抑制中性粒細(xì)胞的趨化,黏附聚集；b、抑制炎性因子的釋放及呼吸爆發(fā)；c

4、、調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞凋亡等三個方面抑制白細(xì)胞過度激活所導(dǎo)致的炎癥損傷反應(yīng)。
　　 目的:在膿毒癥的發(fā)生過程中,可以產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì),包括細(xì)胞因子,趨化因子,補體等,這些炎癥介質(zhì)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)粘附因子的表達(dá),引起血小板的粘附和白細(xì)胞的滲出,目前基本上所有對異丙酚抑制炎癥反應(yīng)方面的研究,都僅僅停留在一些臨床指標(biāo)的觀測上,沒有能夠深入到分子水平上來探討。即使是近來部分研究有分子水平上的探討,但也僅僅是局限在采用幾個細(xì)胞因子指標(biāo),通

5、過不同的干預(yù)方式來檢測一下其表達(dá)水平的變化,從而進(jìn)行初步地探討,也沒有能夠系統(tǒng)地深入到分子機制水平上來,對臨床的指導(dǎo)意義也十分有限。機體的任何反應(yīng)都是通過其復(fù)雜的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)一步步實現(xiàn)的。因此我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗方法,以血清學(xué)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化為突破口,研究內(nèi)毒素血癥大鼠血清蛋白的表達(dá)變化及異丙酚對內(nèi)毒素大鼠血清蛋白的影響。
　　 方法:蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis,2

6、-DE)技術(shù),特別是以固相pH梯度等電聚焦為第息量最大的電泳技術(shù)。到目前為止,雙向電泳仍然以它的高分辨率、高靈敏度以及新技術(shù)的引入(如窄pH梯度、熒光差異標(biāo)記技術(shù)等)而在蛋白質(zhì)組研究中占據(jù)相當(dāng)重要的地位。
　　 功能蛋白質(zhì)組學(xué)通過尋找不同生命過程或疾病過程狀態(tài)下出現(xiàn)的差異蛋白,從而找到與這些生命過程或病理過程功能相關(guān)的蛋白質(zhì)集群。通過生物信息學(xué)(bioinformatics)的原理,我們可以根據(jù)結(jié)構(gòu)域或模體將差異蛋白質(zhì)組分為許多

7、功能子集,然后結(jié)合傳統(tǒng)的研究策略對子集進(jìn)行深入研究。如能獲得足夠信息量的差異蛋白質(zhì)組,就更能為發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互聯(lián)系提供一個機遇。這樣的研究思路不但可以提高研究效率,使我們比較容易找到研究的切入點,也給我們的研究提供一個框架性的基礎(chǔ),使我們通過對蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)的解析,更好地去了解生命過程或生命現(xiàn)象這些較為宏觀的問題。
　　 在上述研究思路指導(dǎo)下,我們建立了2-DE聯(lián)合MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),最后用肽質(zhì)量指紋圖譜(Pepti

8、de Mass Fingerprint,PMF)鑒定蛋白質(zhì),通過Westernbolt法和ELISA對所獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行行驗證,比較受不同刺激組下,內(nèi)毒素血癥大鼠血清蛋白的表達(dá)譜。實驗分為三組:空白對照組:持續(xù)靜脈泵入10％脂肪乳；LPS刺激組:單次靜脈注射3 mg/kg LPS,LPS刺激+異丙酚處理組:單次靜脈注射3 mg/kg LPS后,以20 mg/kg/h持續(xù)靜脈泵入propofol。只有LPS刺激組出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)而LPS刺激

9、+異丙酚處理組出現(xiàn)與之相反趨勢的點才被選擇進(jìn)行分析鑒定。這樣獲得的信息量將大大縮小并且更能準(zhǔn)確反應(yīng)這個過程中血清蛋白質(zhì)的功能變化,結(jié)合生物信息學(xué)分析,將準(zhǔn)確高效地發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素血癥大鼠血清蛋白的表達(dá)變化及異丙酚對內(nèi)毒素大鼠血清蛋白的影響。
　　 結(jié)果:2-DE分離并分析得到的差異點中,獲得有效鑒定的12種血清蛋白質(zhì)中血小板因子-4 platelet factor 4(PF4)和主要尿蛋白前體(major urinaryprotein

10、 precursor)在LPS組表達(dá)量最高。而結(jié)合珠蛋白前體(haptoglobin precursor)、尿蛋白1前體(urinary protein 1 precursor)、載脂蛋白C-Ⅲ(apolipoprotein C-Ⅲ),C鏈區(qū)免疫球蛋白lambda-2 C鏈區(qū)(Ig lambda-2 chain C region),補體C3前體(complement C3 precursor)則在LPS刺激+異丙酚處理組中明顯下調(diào)。而白

11、蛋白a(parvalbumin alpha)表達(dá)量上調(diào)；中性粒細(xì)胞相關(guān)明膠酶載脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin precursor)的表達(dá)量,從對照組到LPS組再到LPS+異丙酚組表達(dá)量逐漸增高；另外與其他兩組相比,LPS組中的血紅蛋白亞基alpha-1/2(hemoglobin subunit alpha-1/2),血紅蛋白亞基beta-1(hemoglobin subuni

12、t beta-1)和peroxiredoxin-2表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　 全身炎癥反應(yīng)與凝血系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,在炎癥反應(yīng)早期,由于LPS的刺激,凝血系統(tǒng)處于一個高凝狀態(tài),大量凝血物質(zhì)被釋放,稱為DIC(disseminated intravascular coagulation)前期如果不能及時糾正,由于凝血因子的大量消耗,而最終導(dǎo)致凝血障礙,DIC形成。血小板因子4(PF4)是巨核細(xì)胞(M K)合成的,存在于白細(xì)胞、M K和

13、血小板A顆粒中的特異性熱穩(wěn)定蛋白,含有70個氨基酸,由4個單體組成,每個單體分子量為7.8KD。PF4屬人趨化因子超家族,C-X-C亞族,定位于人4號染色體長臂,其cDNA含有一個開放閱讀框架,羧基端含有肝素結(jié)合位點。生物活性包括:中和肝素；刺激白細(xì)胞彈性蛋白酶；趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；擬制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、游走和血管的生成。PF4是在血小板被激活時釋放出來的一種促凝因子,是膿毒血癥早期導(dǎo)致血液高凝狀態(tài)的重要因子。在炎癥反應(yīng)

14、過程中,PF4對中心粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都具有趨化作用。因此我們首先選擇了PF4進(jìn)行下一步驗證。我們主要通過westernblot和ELISA法對PF4進(jìn)行了驗證,并對比了不同組間凝血酶原Ⅲ的活性及PT、APTT、TT、Fbg等變化,研究異丙酚對內(nèi)毒素血癥大鼠凝血功能的改變。在正常對照組中PF4的表達(dá)基本看不見,而在LPS組PF4明顯增高,提示注射LPS6h后大鼠凝血系統(tǒng)被激活,處于一種高凝狀態(tài),而在LPS+異丙酚組中,PF4的表達(dá)在此降低

15、,提示在膿毒血癥早期,異丙酚能抑制由LPS誘導(dǎo)的PF4的釋放。
　　 結(jié)論:膿毒癥的發(fā)生過程中,可以產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì),包括細(xì)胞因子,趨化因子,補體等,這些炎癥介質(zhì)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)粘附因子的表達(dá),引起血小板的粘附和白細(xì)胞的滲出。本研究主要通過LPS刺激大鼠,以大鼠血清蛋白作為研究對象,通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得了12種在不同刺激下有差異的蛋白質(zhì)。其中的血小板因子4在凝血、炎癥和組織修復(fù)過程中具有重要作用,而異丙酚可以減少炎癥反應(yīng)