以HERG基因表達(dá)模型為基礎(chǔ)的藥物在心臟復(fù)極方面的安全性評(píng)價(jià).pdf

1、藥物致QT間期延長(zhǎng)的副作用已成為威脅公眾用藥安全的重要問(wèn)題，也是目前藥物安全管理部門和藥物公司廣泛關(guān)注的藥物心臟毒性問(wèn)題。很多藥物可以通過(guò)直接阻斷心肌復(fù)極中的快速激活延遲整流鉀通道電流（IKr），使得復(fù)極時(shí)程延長(zhǎng)，導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)，甚至發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速或心源性猝死；也可以通過(guò)干擾鉀通道蛋白的表達(dá)，間接減少IKr使得QT延長(zhǎng)。藥物對(duì)心臟復(fù)極的不良影響成為美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）終止藥品上市的主要原因之一，并要求所有藥物上市

2、前必須進(jìn)行這方面的評(píng)價(jià)。對(duì)IKr電流的測(cè)定成為判斷藥物是否能引起QT延長(zhǎng)及是否易產(chǎn)生促心律失常作用的一個(gè)指標(biāo)。因此，本研究擬從細(xì)胞離子通道、蛋白水平上建立一套臨床前在體外評(píng)價(jià)藥物對(duì)心臟復(fù)極影響的方法，并應(yīng)用藥物進(jìn)行評(píng)估。據(jù)此，本研究設(shè)計(jì)了三個(gè)分實(shí)驗(yàn)。
　　 第一部分：建立表達(dá)HERG基因的HEK293細(xì)胞模型，并培養(yǎng)出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HERG-HEK293細(xì)胞株；
　　 第二部分：用已知導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)的藥物西沙比利來(lái)測(cè)定該藥

3、對(duì)HERG通道電流的影響，進(jìn)一步明確該通道的特性，并評(píng)價(jià)西沙比利對(duì)HERG通道蛋白的影響；
　　 第三部分：評(píng)價(jià)我國(guó)的一類抗心律失常新藥--鹽酸關(guān)附甲素對(duì)HERG通道電流、通道動(dòng)力學(xué)的影響，并對(duì)HERG基因F656C突變后的電流進(jìn)行測(cè)定，明確藥物與HERG通道結(jié)合位點(diǎn)；應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評(píng)價(jià)關(guān)附甲素對(duì)蛋白表達(dá)的影響。
　　 第一部分：HERG-HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的建立
　　 目

4、的：通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法把HERG基因轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞，使之表達(dá)HERG通道鉀電流及蛋白，達(dá)到建立HERG.HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的目的。
　　 方法：利用LipofectamineTM2000將pCDNA3.0-HERG和綠色熒光蛋白（GFP）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，利用膜片鉗技術(shù)測(cè)定HERG-HEK293細(xì)胞上的HERG鉀電流：應(yīng)用G418對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選，進(jìn)而利用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western

5、 blot）測(cè)定2HERG-HEK293細(xì)胞的HERG蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：LipofectamineTM2000介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功率在30-70％，該方法有效地將HERG基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，并表達(dá)HERG介導(dǎo)HERG通道鉀電流；G418可成功篩選HERG基因陽(yáng)性的克隆細(xì)胞，使得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HERG-HEK293細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并可用于Western blot的研究。
　　 結(jié)論：熒光顯微鏡檢查、膜片鉗及W

6、estern blot研究證實(shí)該HERG-HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的建立成功的。
　　 第二部分：西沙比利對(duì)HERG基因表達(dá)的快速激活延遲整流鉀通道電流及蛋白的影響
　　 目的：評(píng)價(jià)西沙比利對(duì)轉(zhuǎn)染HERG基因表達(dá)的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）和蛋白的影響，探討其致心律失常發(fā)生的機(jī)制。
　　 方法：使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法把野生型HERG基因轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚腎細(xì)胞（HEK293），采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)評(píng)價(jià)西沙比利對(duì)

7、IKr通道電流和動(dòng)力學(xué)的影響；使用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HERG的細(xì)胞，并用西沙比利進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評(píng)價(jià)藥物對(duì)蛋白的影響。
　　 結(jié)果：西沙比利對(duì)IKr通道的刺激電流（IHERG）和尾電流（Itail）具有濃度和電壓依賴性抑制作用，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）分別14.5和3.9 nmol/L。西沙比利使IHERG和Itail的最大峰值電位前移，但不改變激活電位；使激活曲線左移并加快通道

8、的失活，但不改變通道失活后的恢復(fù)時(shí)間；西沙比利對(duì)HERG-HEK293細(xì)胞上的IKr通道蛋白無(wú)明顯抑制。
　　 結(jié)論：西沙比利通過(guò)作用于通道的激活態(tài)及失活態(tài)抑制HERG鉀電流，但不影響HERG通道蛋白的表達(dá)，從而使得心肌復(fù)極時(shí)程延長(zhǎng)，導(dǎo)致心律失常發(fā)生。
　　 第三部分：關(guān)附甲素對(duì)轉(zhuǎn)染HERG基因表達(dá)的快速激活延遲整流鉀通道電流和蛋白的影響
　　 目的：評(píng)價(jià)關(guān)附甲素（GFA）對(duì)HERG基因表達(dá)的鉀通道電流和蛋白的影

9、響。
　　 方法：使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法把野生型HERG基因轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞（HEK293），使之表達(dá)快速激活延遲整流鉀電流（IKr），采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IKr通道電流，觀察不同濃度的關(guān)附甲素對(duì)IKr的影響并進(jìn)行通道動(dòng)力學(xué)研究。采用定點(diǎn)突變技術(shù)使HERG基因產(chǎn)生F656C突變，并應(yīng)用膜片鉗進(jìn)行藥物對(duì)電流影響的測(cè)定。應(yīng)用免疫蛋白印跡技術(shù)（Western blot）評(píng)價(jià)關(guān)附甲素對(duì)HERG鉀通道蛋白的影響。
　　

10、 結(jié)果：
　　 1.關(guān)附甲素對(duì)IKr通道的峰電流IHERG具有濃度和電壓依賴性抑制作用，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為465.95μmol/L；400μmol/L和1000μmol/L的關(guān)附甲素使IHERG的最大峰值電位前移，但不改變激活電位。25～400μmol/L的關(guān)附甲素對(duì)尾電流（Itail）抑制不明顯，1、2.5和5mmol/L的關(guān)附甲素對(duì)抑制率分別為34.9％、58.0％和70.5％，IC50為1.64mmol/L。

11、lmmol/L的關(guān)附甲素對(duì)Itail呈電壓依賴性，并使得最大峰值電位前移，電流-電壓曲線的形狀產(chǎn)生變化，但對(duì)激活電位沒(méi)有影響。關(guān)附甲素對(duì)HERG通道電流的抑制無(wú)時(shí)間依賴性。
　　 2.關(guān)附甲素可以使得通道的激活曲線左移并能加快通道的失活過(guò)程，并且能在-60mV的電壓上減慢通道失活后的恢復(fù)時(shí)間，而對(duì)去激活時(shí)間常數(shù)無(wú)明顯影響。
　　 3.關(guān)附甲素對(duì)F656C突變的HERG通道峰電流（IHERG）和尾電流（Itail）具有抑制

12、效應(yīng)，但抑制程度比野生型HERG電流明顯減弱，并使得激活曲線左移。
　　 4.高濃度的關(guān)附甲素可抑制HERG鉀通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，且對(duì)F656C突變表達(dá)的HERG鉀通道蛋白抑制更明顯。
　　 結(jié)論：25～400μmol/L的關(guān)附甲素對(duì)IKr的抑制作用不明顯，高濃度的關(guān)附甲素可以抑制HERG電流，關(guān)附甲素主要是作用于HERG通道的失活態(tài)和激活態(tài)，并且主要是結(jié)合在HERG通道的S6區(qū)從而抑制鉀電流。關(guān)附甲素不影響HERG蛋白的合