MiRNA-646在脂多糖處理后的A549細胞中的表達及功能分析.pdf

1、背景：
　　 急性呼吸窘迫綜合征(Acute respi ratory distress syndrome，ARDS)是指膿毒癥、重癥肺炎、多發(fā)傷等肺內(nèi)外疾病侵襲機體后出現(xiàn)的炎性因子大量釋放，肺泡上皮細胞損傷及肺表面活性物質(zhì)合成減少為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。其臨床特征包括呼吸頻速和呼吸窘迫，進行性低氧血癥，X線呈現(xiàn)彌漫性肺浸潤影。雖然治療手段在不斷增加，但ARDS現(xiàn)在仍是PICU中威脅人類生命的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，美國每年有19

2、萬的ARDS病人，死亡率高達39.4％;而我國的死亡率更高，達到71.4％?，F(xiàn)階段ARDS的發(fā)病機制尚未完全明了，但是在ARDS時肺表面活性物質(zhì)合成是減少的。Schmidt等發(fā)現(xiàn)在ARDS患者的肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A(surfactant associated protein A，SP-A)、肺表面活性蛋白B(surfactant associated protein B，SP-B)、肺表面活性蛋白C(surfactantasso

3、ciated protein C，SP-C)、二棕櫚酰卵磷脂明顯減少，隨著ARDS的好轉(zhuǎn)，它們的量相應(yīng)的增加。在嚴重的ARDS病人給予SP-C后，能夠明顯的減輕缺氧，減少死亡率。
　　 microRNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，它能對細胞的生長、分化、凋亡及關(guān)鍵蛋白的分泌等各個層面進行調(diào)節(jié)。多種miRNA在同一個細胞中的表達使得細胞處在一

4、種內(nèi)在的miRNA環(huán)境中，這個環(huán)境控制著成千上萬的編碼基因的mRNA，使得各種蛋白的表達處在一個合適的水平，調(diào)控各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達。
　　 現(xiàn)階段人們越來越重視miRNA和肺部疾病的關(guān)系的研究，人們已經(jīng)對miRNA和肺的生長發(fā)育、肺纖維化、肺部腫瘤、肺部炎癥等方面進行了研究，并且證實了miRNA參與了上述的生命活動。ARDS的發(fā)病機制仍未完全明了，缺乏有效的治療手段，miRNA在ARDS發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越引起人們的重視

5、。miRNA機制的研究可能是基因、蛋白水平有關(guān)ARDS/ALI發(fā)病機制及治療研究的重要補充。目前對ARDS發(fā)病機制方面的報道很少涉及miRNA，ARDS時在miRNA水平有什么變化？我們通過miRNA芯片檢測損傷前和損傷后的A549細胞，發(fā)現(xiàn)大量差異表達的miRNA。我們進一步對差異表達的miRNA進行靶基因的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因和肺表面活性相關(guān)蛋白、肺的生長發(fā)育、炎癥、細胞凋亡、腫瘤等方面相關(guān)。我們選擇了和肺表面活性相關(guān)蛋白相

6、關(guān)的miRNA-646(miR-646)進行下面的實驗，進一步探討miR-646在實驗中的變化，預(yù)測miR-646的靶基因，進一步完善ARDS的發(fā)病機制，為ARDS的治療提供新的靶點。
　　 目的：
　　 1.檢測A549細胞通過脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理前后SP-A、SP-C表達量的變化。
　　 2.通過微陣列芯片技術(shù)測定LPS處理A549細胞前后miRNA的差異表達譜，確定進行

7、下面實驗的差異表達的目標miRNA和目標靶基因。
　　 3.探討miRNA參與ARDS發(fā)生發(fā)展過程中可能的機制，為ARDS的診治尋找新的靶點。
　　 方法：
　　 1.實驗分為實驗組及對照組，對照組是以RPMI-1640培養(yǎng)液處理A549細胞24小時;實驗組分別以5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的LPS處理A549細胞24小時。通過免疫細胞化學染色、western blot法檢測各組細胞中的SP-A、

8、SP-C的表達量。并用RT-PCR方法檢測各組細胞中SP-A、SP-C的mRNA的表達量。
　　 2.利用miRNA基因芯片檢測10μg/ml的LPS處理前后A549細胞，找出其中差異表達大的miRNA。利用生物信息學軟件(TargetScan，miRanda，Clip-seq，miRDB)預(yù)測差異表達大的miRNA的靶基因，找到一個靶基因蛋白在ARDS發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用的目標靶基因，確定目標miRNA和目標靶基因。并用

9、實時熒光定量PCR的方法檢測各組細胞中目標miRNA的表達量，驗證基因芯片的準確性。并做目標miRNA的表達和目標靶基因蛋白表達的相關(guān)性分析。
　　 3.體外驗證目標miRNA對目標靶基因蛋白的的調(diào)控作用。實驗分為五組，分別為mock組、miRNA mimics組、miRNA mimics control組、miRNA inhibitor組、miRNA inhibitor control組。mock組轉(zhuǎn)染A549細胞時候加miR

10、NA mimics，不加轉(zhuǎn)染劑;余各組轉(zhuǎn)染時候A549細胞液分別轉(zhuǎn)染miRNA mimics、miRNA mimicscontrol、miRNA inhibitor、miRNA inhibitor control。轉(zhuǎn)染24小時后做實時熒光定量PCR驗證各組細胞中目標miRNA的表達量，驗證轉(zhuǎn)染效果。最后用western blot法檢測各組細胞中的靶基因蛋白的表達量。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組細胞中SP-A、SP-C的

11、表達量
　　 1.1 LPS處理前A549細胞形態(tài)為多角形，胞質(zhì)飽滿，有胞質(zhì)突起，呈貼壁生長，長滿時融合成片，無核固縮的現(xiàn)象。LPS處理細胞24 h后，A549細胞形念變圓，體積縮小，胞質(zhì)變空亮，且胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒。
　　 1.2 免疫細胞化學染色檢測各組A549細胞SP-A、SP-C的表達量SP-A在對照組的相對表達量是0.0754±0.0009，在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.0707±0.001

12、9，在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.0424±0.0028，在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.0155±0.0019，實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(F=534.498，P＜0.05)。SP-C在對照組的相對表達量是0.0508±0.0035，在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.0268±0.0035，在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.0148±0.0025，在15μg/ml脂多糖處理組

13、的相對表達量是0.0226±0.0035，實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(F=68.388，P＜0.05)。
　　 1.3 western blot檢測各組A549細胞SP-A、SP-C的表達量LPS處理細胞24 h后western blot檢測SP-A的表達量實驗組較對照組均下降，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，且隨著脂多糖濃度的增加，SP-A的表達量越低，呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。western blot檢測SP-C的表達量實驗

14、組較對照組均下降，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，10μg/ml脂多糖處理組SP-C的表達量最低。
　　 1.4 實時熒光定量PCR檢測各組細胞SP-A、SP-C的mRNA的表達量SP-A的mRNA在對照組的相對表達量是1.0509±0.0368，在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.9333±0.0146，在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.5630±0.0097，在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.2

15、636±0.0248，實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(F=676.753，P＜0.01)。SP-C的mRNA在對照組的相對表達量是1.0442±0.1559，在5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.5039±0.0175，在10μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.2306±0.0574，在15μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是0.3987±0.0084，實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(F=21.635，P＜0.01)。

16、
　　 以上結(jié)果表明在實驗組中各組細胞的SP-A、SP-C的表達量較對照組均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這和在臨床上ARDS時SP-A、SP-C的表達是一致的。
　　 2.芯片結(jié)果和確定目標miRNA、靶基因
　　 2.1 miRNA芯片檢測結(jié)果顯示:篩選出處理前后2倍以上表達差異的miRNAs:表達顯著上調(diào)的有31個，其中表達差異最大的兩個為miR-646、miR-1247-3p，miR-646差

17、異達3.4倍，miR-1247-3p差異達3.2倍;顯著下調(diào)的有13個，其中表達差異最大的兩個為miR-4455、miR-374b-5p，miR-4455下調(diào)至0.32倍，miR-374b-5p下調(diào)至0.36倍。并用TargetScan，miRanda，Clip-seq，miRDB對差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測。4個軟件預(yù)測miR-646共有512個靶基因，其中四個軟件共有的靶基因有176個。在共有靶基因中發(fā)現(xiàn)一個候選靶基因為sf

18、tpc，它編碼的蛋白為SP-C。SP-C在ARDS發(fā)病過程中起重要作用。所以確定進行下面實驗的目標miRNA為miR-646，確定目標靶基因蛋白為SP-C。
　　 2.2 實時熒光定量PCR的方法檢測各組細胞中miR-646的表達量結(jié)果顯示對照組miR-646的表達量是0.9597±0.020，5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是1.6319±0.1325，10μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是2.4762±0.1380，1

19、5μg/ml脂多糖處理組的相對表達量是1.6642±0.0938。實驗組和對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其中10μg/ml組的相對表達量最高。這和miRNA芯片結(jié)果是一致的，驗證了芯片的準確性。
　　 2.3 對miR-646的表達量和SP-C的表達量的相關(guān)性分析:脂多糖處理A549細胞后，miR-646的表達量和SP-C的表達量有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，并且呈明顯的濃度依賴的負相關(guān)（pearson相關(guān)系數(shù)r=

20、-0.916）。
　　 3.在體外驗證在miR-646對SP-C的調(diào)控作用
　　 3.1 轉(zhuǎn)染48小時后在熒光顯微鏡下觀察見到細胞胞漿中有綠色熒光。收集細胞后對各組細胞做實時熒光定量PCR顯示:mock組miR-646的相對表達量是256.85±90.12，miR-646 mimics組miR-646的相對表達量是194215.66±12555.57，miR-646 mimics control組miR-646的相對表達

21、量是145.99±22.40，miR-646 inhibitor組miR-646的相對表達量是1.04±0.23，miR-646 inhibitorcontrol組miR-646的相對表達量是173.59±15.94。miR-646 mimics組、miR-646 inhibitor組和mock組的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。
　　 3.2 western blot檢測轉(zhuǎn)然后各組A549細胞中SP-C的表達

22、量。與mock組相比，miR-646 mimics組SP-C的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與mock組相比，miR-646 inhibitor組SP-C的表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與mock組相比，miR-646 mimics control組、miR-646 inhibitor control組SP-C的表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：