外源基因轉(zhuǎn)化冷季型草坪草培育抗除草劑、抗旱新種質(zhì)的研究.pdf

1、本研究將Bar-Gus基因、NAS基因轉(zhuǎn)進(jìn)草坪草中，初步觀(guān)察，轉(zhuǎn)化株對(duì)除草劑的耐性以及抗旱性增強(qiáng)。并對(duì)轉(zhuǎn)NAS基因的轉(zhuǎn)化株進(jìn)一步檢測(cè)，通過(guò)觀(guān)察氣孔開(kāi)度、測(cè)量泡狀細(xì)胞大小等方法從形態(tài)解剖上對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性進(jìn)行鑒定；另外，對(duì)轉(zhuǎn)NAS基因植株在干旱條件下的質(zhì)膜透性、葉綠素含量、體內(nèi)游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化氫酶活性等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，從而證實(shí)其抗旱性的增強(qiáng)。并就NAS基因增強(qiáng)植物抗旱性的作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，為此基因的

2、應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究不僅具有較深的理論意義，實(shí)際意義也很深遠(yuǎn)，必將推動(dòng)我國(guó)草坪業(yè)乃至整個(gè)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。 1.四種冷季型草坪草遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴(lài)于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。本研究在這方面取得了以下結(jié)果： 建立了匍匐翦股穎(AgrostisstoloniferaL.)、草地早熟禾(PoapratensisL.)、高羊茅(FestucaarundinaceaSchreb)和多年生黑麥草(Lolium

3、perreneL.)胚性愈傷組織高頻誘導(dǎo)與再生系統(tǒng)。研究結(jié)果表明，成熟胚是誘導(dǎo)愈傷組織最理想的外植體，草地早熟禾、高羊茅可以通過(guò)切除成熟胚部分胚乳，濃鹽酸處理等方法縮短其出愈時(shí)間。匍匐翦股穎、草地早熟禾愈傷組織最適合的基本培養(yǎng)基是NB培養(yǎng)基，高羊茅、多年生黑麥草愈傷組織最適合的基本培養(yǎng)基是CC培養(yǎng)基。在適當(dāng)?shù)?，4-D濃度下，其愈傷組織最高誘導(dǎo)率分別為：78.74％、78.7％、86.25％和71％，對(duì)于繼代兩次胚性生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組

4、織分化率可達(dá)90.91％、90％、88.10％和90％。 建立了匍匐翦股穎、草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麥草抗性愈傷組織的篩選方案。對(duì)這幾種愈傷組織的篩選，選用G418、Hyg、Bar作篩選劑效果較好，其適宜的篩選濃度分別為匍匐翦股穎G41830-40mg/L、Hyg50mg/L，草地早熟禾G41840-50mg/L、Hyg50mg/L，高羊茅G41840-50mg/L、Hyg50mg/L，多年生黑麥草G418150-200mg

5、/L、Hyg30-40mg/L、Basta10-20其篩選時(shí)間均以40-60天為宜，而且在愈傷組織繼代、分化過(guò)程中一直進(jìn)行篩選。 通過(guò)第一階段的研究，這四種冷季型草坪草愈傷組織再生體系已完全具備了遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的基本條件。這一結(jié)果將為今后匍匐翦股穎、草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麥草同種的草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立奠定牢固的基礎(chǔ)，也是冷季型草坪草的品種改良邁出的最重要的第一步。 2.多年生黑麥草基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立及

6、其Bar-Gus基因轉(zhuǎn)化的研究本研究進(jìn)行了首次將抗除草劑(Bar)基因?qū)?種多年生黑麥草品種的研究。優(yōu)化了多年生黑麥草愈傷組織基因槍轉(zhuǎn)化方法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：選用900psi壓力膜的轉(zhuǎn)化效果較好，其抗性愈傷組織的獲得率為16％左右。以每槍500μg金粉吸附1μgpBarGus質(zhì)粒DNA的用量、6cm的轟擊距離和900psi的壓力膜的參數(shù)，對(duì)多年生黑麥草進(jìn)行了每皿轟擊1槍?zhuān)?槍和3槍的比較。轟擊材料經(jīng)Bastar20mg/L篩選

7、40天后的結(jié)果表明，在受體材料不移動(dòng)位置的情況下，轟擊次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響不大，但若是每轟擊一槍后轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿的方向，并翻動(dòng)受體材料，則以轟擊2槍的效果為好。 首次獲得了Bar-Gus基因多年生黑麥草植株。應(yīng)用本研究?jī)?yōu)化的基因槍轉(zhuǎn)化方法，將Bar-Gus基因?qū)氲搅?種多年生黑麥草品種愈傷組織中，通過(guò)篩選劑的篩選獲得了36株獨(dú)立來(lái)源的轉(zhuǎn)化植株。選取部分植株進(jìn)行PCR和Southern雜交分子檢測(cè)的結(jié)果表明，外源基因己整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植

8、株的基因組。 3.匍匐翦股穎農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立及其N(xiāo)AS基因轉(zhuǎn)化的研究本研究進(jìn)行了首次將煙堿酰胺合成酶(NAS)基因?qū)?種匍匐翦股穎品種的研究。優(yōu)化了匍匐翦股穎愈傷組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株對(duì)匍匐翦股穎的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于LBA4404和AGL1菌株的轉(zhuǎn)化效果；農(nóng)桿菌浸染之前將胚性愈傷組織真空干燥2分鐘可以縮短共培養(yǎng)時(shí)間，提高轉(zhuǎn)化頻率；在共培養(yǎng)過(guò)程完成后進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)培養(yǎng)，然后利用一

9、步篩選法對(duì)抗性愈傷組織進(jìn)行篩選，既可降低污染幾率，又可提高抗性愈傷組織分化頻率。 首次獲得了轉(zhuǎn)NAS基因匍匐翦股穎植株。應(yīng)用本研究?jī)?yōu)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，將NAS基因?qū)氲搅?種匍匐翦股穎品種愈傷組織中，通過(guò)篩選劑的篩選獲得了101株獨(dú)立來(lái)源的轉(zhuǎn)化植株。選取部分植株進(jìn)行PCR和Southern雜交分子檢測(cè)的結(jié)果表明，外源基因己整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的基因組。 4.匍匐翦股穎轉(zhuǎn)基因植株抗旱性的鑒定以匍匐翦股穎轉(zhuǎn)NAS基因植株及對(duì)照

10、植株為實(shí)驗(yàn)材料，利用反復(fù)干旱法對(duì)其抗旱性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)初期，轉(zhuǎn)化株與對(duì)照株的株高增長(zhǎng)速度較快，分別為14.18cm，17.57cm。隨著反復(fù)干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，株高增長(zhǎng)速度減慢，到后期甚至停滯。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照株葉片大量枯黃，而轉(zhuǎn)化株葉片雖有部分萎蔫、枯黃，但整體觀(guān)感較好，表現(xiàn)出很好的抗逆性。 對(duì)其抗旱相關(guān)形態(tài)解剖指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)化株呈現(xiàn)葉機(jī)械組織發(fā)達(dá)，葉脈密(維管束數(shù)目增多)，維管束的木質(zhì)部

11、導(dǎo)管數(shù)目增多，葉上表皮泡狀細(xì)胞大，深入葉肉1/3以上，氣孔常呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)等抗旱植物的形態(tài)表現(xiàn)；同時(shí)，對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜、及葉綠體膜、線(xiàn)粒體膜等內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化株與對(duì)照株相比，受損程度要小一些，膜結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明細(xì)胞的抗旱保護(hù)體系運(yùn)轉(zhuǎn)正常。 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株干旱條件下生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明：在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)化株及對(duì)照株葉綠素含量、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化氫酶活性、體內(nèi)游離脯氨酸含量、質(zhì)膜透性均出現(xiàn)顯著差

12、異，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異更顯著，至干旱脅迫40天，轉(zhuǎn)化株超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化氫酶活性、體內(nèi)游離脯氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照株，有這些保護(hù)性酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的參與，質(zhì)膜通透性雖有增加，但沒(méi)有對(duì)照株明顯，同時(shí)葉綠素含量也下降較慢，葉片色澤仍為淡綠。 通過(guò)反復(fù)干旱法，以及一系列抗旱相關(guān)形態(tài)解剖指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的鑒定可以確定，轉(zhuǎn)NAS基因植株與對(duì)照植株相比，其抗旱性有明顯增強(qiáng)，并做出以下推斷：NAS基因的導(dǎo)入，可以增強(qiáng)植物對(duì)

13、Fe離子的吸收和運(yùn)輸能力，使Fe離子參與的生理活動(dòng)如：光合作用、呼吸作用、核酸和蛋白質(zhì)的合成、氮的固定在干旱脅迫之下仍能進(jìn)行，更重要的是，NAS基因的直接合成產(chǎn)物NA可能增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)生物膜在干旱脅迫下結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 綜上所述，本研究在草坪草遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立中作了一些基礎(chǔ)的研究，對(duì)NAS基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、NAS轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性鑒定和NAS基因的作用機(jī)理進(jìn)行了開(kāi)創(chuàng)性研究，為抗旱冷季型草坪草新種質(zhì)的培育打下了堅(jiān)實(shí)