外源基因轉化冷季型草坪草培育抗除草劑、抗旱新種質的研究.pdf

1、本研究將Bar-Gus基因、NAS基因轉進草坪草中，初步觀察，轉化株對除草劑的耐性以及抗旱性增強。并對轉NAS基因的轉化株進一步檢測，通過觀察氣孔開度、測量泡狀細胞大小等方法從形態(tài)解剖上對轉基因植株的抗旱性進行鑒定；另外，對轉NAS基因植株在干旱條件下的質膜透性、葉綠素含量、體內游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性等生理生化指標進行測定，從而證實其抗旱性的增強。并就NAS基因增強植物抗旱性的作用機理進行深入研究，為此基因的

2、應用提供理論依據。本研究不僅具有較深的理論意義，實際意義也很深遠，必將推動我國草坪業(yè)乃至整個農業(yè)的發(fā)展。 1.四種冷季型草坪草遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。本研究在這方面取得了以下結果： 建立了匍匐翦股穎(AgrostisstoloniferaL.)、草地早熟禾(PoapratensisL.)、高羊茅(FestucaarundinaceaSchreb)和多年生黑麥草(Lolium

3、perreneL.)胚性愈傷組織高頻誘導與再生系統(tǒng)。研究結果表明，成熟胚是誘導愈傷組織最理想的外植體，草地早熟禾、高羊茅可以通過切除成熟胚部分胚乳，濃鹽酸處理等方法縮短其出愈時間。匍匐翦股穎、草地早熟禾愈傷組織最適合的基本培養(yǎng)基是NB培養(yǎng)基，高羊茅、多年生黑麥草愈傷組織最適合的基本培養(yǎng)基是CC培養(yǎng)基。在適當?shù)?，4-D濃度下，其愈傷組織最高誘導率分別為：78.74％、78.7％、86.25％和71％，對于繼代兩次胚性生長狀態(tài)良好的愈傷組

4、織分化率可達90.91％、90％、88.10％和90％。 建立了匍匐翦股穎、草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麥草抗性愈傷組織的篩選方案。對這幾種愈傷組織的篩選，選用G418、Hyg、Bar作篩選劑效果較好，其適宜的篩選濃度分別為匍匐翦股穎G41830-40mg/L、Hyg50mg/L，草地早熟禾G41840-50mg/L、Hyg50mg/L，高羊茅G41840-50mg/L、Hyg50mg/L，多年生黑麥草G418150-200mg

5、/L、Hyg30-40mg/L、Basta10-20其篩選時間均以40-60天為宜，而且在愈傷組織繼代、分化過程中一直進行篩選。 通過第一階段的研究，這四種冷季型草坪草愈傷組織再生體系已完全具備了遺傳轉化受體系統(tǒng)的基本條件。這一結果將為今后匍匐翦股穎、草地早熟禾、高羊茅和多年生黑麥草同種的草坪草的遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立奠定牢固的基礎，也是冷季型草坪草的品種改良邁出的最重要的第一步。 2.多年生黑麥草基因槍轉化系統(tǒng)的建立及

6、其Bar-Gus基因轉化的研究本研究進行了首次將抗除草劑(Bar)基因導入3種多年生黑麥草品種的研究。優(yōu)化了多年生黑麥草愈傷組織基因槍轉化方法。 實驗結果表明：選用900psi壓力膜的轉化效果較好，其抗性愈傷組織的獲得率為16％左右。以每槍500μg金粉吸附1μgpBarGus質粒DNA的用量、6cm的轟擊距離和900psi的壓力膜的參數(shù)，對多年生黑麥草進行了每皿轟擊1槍，2槍和3槍的比較。轟擊材料經Bastar20mg/L篩選

7、40天后的結果表明，在受體材料不移動位置的情況下，轟擊次數(shù)對轉化效果的影響不大，但若是每轟擊一槍后轉動培養(yǎng)皿的方向，并翻動受體材料，則以轟擊2槍的效果為好。 首次獲得了Bar-Gus基因多年生黑麥草植株。應用本研究優(yōu)化的基因槍轉化方法，將Bar-Gus基因導入到了3種多年生黑麥草品種愈傷組織中，通過篩選劑的篩選獲得了36株獨立來源的轉化植株。選取部分植株進行PCR和Southern雜交分子檢測的結果表明，外源基因己整合進轉基因植

8、株的基因組。 3.匍匐翦股穎農桿菌轉化系統(tǒng)的建立及其NAS基因轉化的研究本研究進行了首次將煙堿酰胺合成酶(NAS)基因導入3種匍匐翦股穎品種的研究。優(yōu)化了匍匐翦股穎愈傷組織農桿菌轉化方法。 實驗結果表明，根癌農桿菌EHA105菌株對匍匐翦股穎的轉化效果優(yōu)于LBA4404和AGL1菌株的轉化效果；農桿菌浸染之前將胚性愈傷組織真空干燥2分鐘可以縮短共培養(yǎng)時間，提高轉化頻率；在共培養(yǎng)過程完成后進行較長時間的恢復培養(yǎng)，然后利用一

9、步篩選法對抗性愈傷組織進行篩選，既可降低污染幾率，又可提高抗性愈傷組織分化頻率。 首次獲得了轉NAS基因匍匐翦股穎植株。應用本研究優(yōu)化的農桿菌轉化方法，將NAS基因導入到了3種匍匐翦股穎品種愈傷組織中，通過篩選劑的篩選獲得了101株獨立來源的轉化植株。選取部分植株進行PCR和Southern雜交分子檢測的結果表明，外源基因己整合進轉基因植株的基因組。 4.匍匐翦股穎轉基因植株抗旱性的鑒定以匍匐翦股穎轉NAS基因植株及對照

10、植株為實驗材料，利用反復干旱法對其抗旱性進行測定，結果表明：在實驗初期，轉化株與對照株的株高增長速度較快，分別為14.18cm，17.57cm。隨著反復干旱時間的延長，株高增長速度減慢，到后期甚至停滯。到實驗結束，對照株葉片大量枯黃，而轉化株葉片雖有部分萎蔫、枯黃，但整體觀感較好，表現(xiàn)出很好的抗逆性。 對其抗旱相關形態(tài)解剖指標進行鑒定，結果表明：在干旱脅迫條件下，轉化株呈現(xiàn)葉機械組織發(fā)達，葉脈密(維管束數(shù)目增多)，維管束的木質部

11、導管數(shù)目增多，葉上表皮泡狀細胞大，深入葉肉1/3以上，氣孔常呈現(xiàn)關閉狀態(tài)等抗旱植物的形態(tài)表現(xiàn)；同時，對細胞超微結構進行觀察還發(fā)現(xiàn)，質膜、及葉綠體膜、線粒體膜等內膜結構，轉化株與對照株相比，受損程度要小一些，膜結構的相對穩(wěn)定，說明細胞的抗旱保護體系運轉正常。 對轉基因植株干旱條件下生理生化指標進行測定的結果表明：在干旱脅迫條件下，轉化株及對照株葉綠素含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、體內游離脯氨酸含量、質膜透性均出現(xiàn)顯著差

12、異，且隨著脅迫時間的延長，這種差異更顯著，至干旱脅迫40天，轉化株超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、體內游離脯氨酸含量遠遠高于對照株，有這些保護性酶及滲透調節(jié)物質的參與，質膜通透性雖有增加，但沒有對照株明顯，同時葉綠素含量也下降較慢，葉片色澤仍為淡綠。 通過反復干旱法，以及一系列抗旱相關形態(tài)解剖指標、生理生化指標的鑒定可以確定，轉NAS基因植株與對照植株相比，其抗旱性有明顯增強，并做出以下推斷：NAS基因的導入，可以增強植物對

13、Fe離子的吸收和運輸能力，使Fe離子參與的生理活動如：光合作用、呼吸作用、核酸和蛋白質的合成、氮的固定在干旱脅迫之下仍能進行，更重要的是，NAS基因的直接合成產物NA可能增強細胞的抗氧化能力，保護生物膜在干旱脅迫下結構的穩(wěn)定性。 綜上所述，本研究在草坪草遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立中作了一些基礎的研究，對NAS基因的農桿菌轉化、NAS轉基因植株的抗旱性鑒定和NAS基因的作用機理進行了開創(chuàng)性研究，為抗旱冷季型草坪草新種質的培育打下了堅實