KiM-1小鼠模型的構(gòu)建及其腎纖維化機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：腎臟損傷因子-1(Kidney Injury Molecule1,Kim-1)是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由甲肝病毒受體-1(HAVcr-1)基因編碼,其細(xì)胞外片段由一個(gè)粘液素功能區(qū)連接一個(gè)由六個(gè)半胱氨酸組成的球蛋白樣功能區(qū)構(gòu)成。正常情況下,腎臟組織幾乎不表達(dá)Kim-1蛋白,但是在腎臟損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)Kim-1的表達(dá)水平即顯著升高。通過原位雜交和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)Kim-1主要表達(dá)于損傷后再生的去分化近端腎小管上皮細(xì)胞,尤其在近端小管S3段

2、豐富的外髓質(zhì)區(qū)域。研究證實(shí)腎小管細(xì)胞損傷后,Kim-1蛋白的胞外片段在活化的MAP激酶作用下脫落到尿液中排出體外,通過檢測尿液中Kim-1水平能夠早期靈敏診斷急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)。近10余年來的臨床前期及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)尿液Kim-1水平是AKI早期診斷及預(yù)后評估的靈敏指標(biāo)。與多數(shù)傳統(tǒng)使用的生物學(xué)指標(biāo)相比較(血肌酐,血尿素氮等),Kim-1具有更高的靈敏度和特異性,其表達(dá)水平能夠反映腎臟的實(shí)際病理損傷

3、程度(具體可參考綜述一)。目前,急性腎損傷網(wǎng)絡(luò)(Acute Kidney Injury Network,AKIN)已經(jīng)將尿液Kim-1列為AKI的領(lǐng)先診斷指標(biāo)之一。
　　近年來腎臟病學(xué)者發(fā)現(xiàn)Kim-1在腎小管損傷過程中不僅僅只是一個(gè)“結(jié)果表現(xiàn)”,同時(shí)也是腎臟病理損傷及修復(fù)過程的“參與者”。美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Bonventre實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在大鼠AKI發(fā)生后Kim-1能夠促使腎小管上皮細(xì)胞向“半專業(yè)”吞噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而發(fā)揮清除凋亡細(xì)胞和

4、壞死組織碎片的作用。對AKI的病理生理機(jī)制研究已經(jīng)證實(shí),壞死組織碎片的清除有利于腎小管上皮細(xì)胞的再生及小管重構(gòu),是AKI后炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),因此,Kim-1在AKI損傷一修復(fù)過程中具有重要的保護(hù)作用。然而,對慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)的研究發(fā)現(xiàn),尿液Kim-1水平與部分CKD的發(fā)病及預(yù)后具有很高相關(guān)性,在Kim-1表達(dá)明顯的區(qū)域,腎小管損傷、炎癥反應(yīng)及纖維化程度嚴(yán)重,提示Kim-1可能參與調(diào)控C

5、KD的發(fā)生發(fā)展。以上研究結(jié)果提示Kim-1在AKI及CKD的疾病過程中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用,可能是調(diào)控急、慢性腎臟損傷轉(zhuǎn)歸的重要樞紐因子,但其具體分子機(jī)制仍不清楚。因此,深入探討Kim-1在腎組織中的病理生理功能,將有助于更好了解CKD及腎臟纖維化的發(fā)病機(jī)制,并可能發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)治療的靶點(diǎn)。
　　由于Kim-1在正常腎臟組織中幾乎不表達(dá),目前仍缺乏有效研究Kim-1體內(nèi)功能的動物模型。為此,本課題將通過構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞條件性表達(dá)K

6、im-1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,探討Kim-1慢性表達(dá)對小鼠腎組織的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。課題主要包括三部分:
　　1.Kim-1小鼠模型的構(gòu)建及表型鑒定;
　　2.腎小管上皮細(xì)胞條件性表達(dá)Kim-1致腎臟炎癥損傷及纖維化的機(jī)制研究;
　　3.mTOR信號通路介導(dǎo)Kim-1REC-tg小鼠腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究。
　　第一章:Kim-1小鼠模型的構(gòu)建及其表型鑒定
　　目的：構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞條件性表達(dá)Kim-

7、1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠,探討Kim-1慢性表達(dá)對小鼠腎臟的影響。
　　方法：通過Cre/Loxp位點(diǎn)重組酶原理構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,首先體外構(gòu)建依賴Cre重組酶活性表達(dá)的Kim-1及堿性磷酸酶(AP)線性基因片段(Z/Kim-AP)。顯微注射方法將Z/Kim-AP基因片段導(dǎo)入FVB小鼠受精卵前核,將轉(zhuǎn)基因后的受精卵植入假孕FVB雌鼠體內(nèi),三周后獲得Z/Kim-AP轉(zhuǎn)基因小鼠。Z/Kim-AP小鼠與Six2-GFPCre小鼠(Six2為啟動子

8、)雜交后獲得皮質(zhì)及外髓腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Kim-1蛋白的雙基因雜交鼠(Kim-1REC-tg)。PCR及免疫組化方法進(jìn)行小鼠基因型鑒定。按PCR結(jié)果,篩選Kim-1陽性表達(dá)的Kim-1REC-tg小鼠,同窩Kim-1陰性小鼠作為對照組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),檢測不同周齡小鼠的血肌酐(Scr)、電解質(zhì)、紅細(xì)胞比容(Hct)、尿蛋白、尿NAG、尿Kim-1及各項(xiàng)生理指標(biāo)(血壓、體重、生存率)情況,小鼠腎組織行電鏡及免疫組化分析。
　　結(jié)

9、果：PCR基因型鑒定結(jié)果表明Kim-1REC-tg小鼠的出生率符合孟德爾比例,Kim-1REC-tg小鼠出生后腎臟組織即表達(dá)Kim-1 mRNA及蛋白。新生Kim-1REC-tg小鼠腎臟重量及腎單位總數(shù)較對照組分別少23％和46％,但腎小球平均直徑未見明顯差異。新生小鼠腎臟病理學(xué)檢查較對照組未見顯著差異。兩周齡Kim-1REC-tg小鼠病理學(xué)檢查示局部小管空泡變性及上皮細(xì)胞退行性變,余腎小球、腎間質(zhì)及腎血管未見明顯異常。4周齡小鼠腎臟出

10、現(xiàn)明顯病理損傷,部分腎小管空泡變性,管腔擴(kuò)張及蛋白管型形成,腎間質(zhì)局部單個(gè)核細(xì)胞浸潤,少量腎小球局灶性硬化。12周齡Kim-1REC-tg小鼠腎臟出現(xiàn)廣泛炎性細(xì)胞浸潤,腎小管細(xì)胞壞死脫落,大量蛋白及細(xì)胞管型形成,腎間質(zhì)顯著纖維化,彌漫性腎小球球性硬化。Kim-1REC-tg小鼠血肌酐水平在6-10周始較對照組顯著升高,并進(jìn)行性加重,多數(shù)Kim-1REC-tg小鼠在11周(中值)左右因自發(fā)性腎功能衰竭死亡。尿蛋白檢測提示Kim-1REC-

11、tg小鼠自4周始出現(xiàn)進(jìn)行性加重的蛋白尿。Kim-1REC-tg小鼠同時(shí)合并慢性腎功能衰竭的并發(fā)癥,包括貧血,低蛋白血癥,高血壓及水電解質(zhì)紊亂。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建首個(gè)腎小管上皮細(xì)胞條件性過表達(dá)Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠;
　　2.Kim-1REC-tg小鼠合并慢性腎功能衰竭的多種并發(fā)癥,具有CKD進(jìn)行性發(fā)展的典型疾病表型;
　　3.腎小管上皮細(xì)胞條件性表達(dá)Kim-1誘導(dǎo)腎臟炎癥損傷及纖維化,提示Kim-

12、1是抗腎臟纖維化治療的潛在靶點(diǎn)。
　　第二章Kim-1慢性表達(dá)致腎臟炎癥損傷及纖維化機(jī)制研究
　　目的：探討Kim-1慢性表達(dá)致腎臟進(jìn)行性炎癥損傷及纖維化的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：免疫熒光染色評估不同年齡組小鼠F4/80陽性細(xì)胞的數(shù)目及分布情況。取不同年齡組Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)組織提取mRNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime-PCR)分析各組間生長因子(PDGF-b等)及炎癥因子(TN

13、F-α等)表達(dá)水平的差異。取4周齡Kim-1REC-tg小鼠,原代培養(yǎng)純化分離后的腎小管上皮細(xì)胞,4-5天后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,ELISA法檢測TNF-α的表達(dá)水平。構(gòu)建腎缺血再灌注損傷(IRI)小鼠模型,取損傷后72小時(shí)腎臟組織免疫組化共染色,分析Ki67陽性細(xì)胞與Kim-1表達(dá)的分布關(guān)系。Kim-1REC-tg小鼠腎臟組織免疫組化染色,計(jì)數(shù)不同年齡組小鼠腎皮質(zhì)區(qū)Ki67陽性的小管上皮細(xì)胞及腎小球細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)間質(zhì)內(nèi)CD3+細(xì)胞數(shù)。

14、　　結(jié)果：免疫熒光共染色結(jié)果顯示,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎間質(zhì)大量F4/80陽性細(xì)胞浸潤,且多圍繞Kim-1陽性腎小管,10周齡Kim-1REC-tg小鼠上述表現(xiàn)更顯著。CD3+T細(xì)胞免疫組化染色及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果示,4周后的Kim-1REC-tg小鼠腎小管周一腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯CD3+細(xì)胞浸潤,12周后CD3+T細(xì)胞數(shù)顯著增加,部分CD3+細(xì)胞遷移進(jìn)入小管腔,上述結(jié)果提示Kim-1對炎癥細(xì)胞具有顯著趨化作用。Realtime-P

15、CR結(jié)果示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)即出現(xiàn)炎癥反應(yīng)(IL-6、CXCL-1和MCP-1表達(dá)增高),4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)炎癥級聯(lián)反應(yīng)加重,多種炎癥因子表達(dá)水平顯著上調(diào),10周齡小鼠腎皮質(zhì)多種炎癥因子水平升高數(shù)十至數(shù)百倍,提示Kim-1誘導(dǎo)Kim-1REC-tg小鼠腎組織進(jìn)行性加重的炎癥反應(yīng)。4周齡Kim-1REC-tg小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中TNF-α水平較對照組顯著升高,進(jìn)一步支持表達(dá)Kim-1的腎

16、小管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子促發(fā)腎臟炎癥級聯(lián)反應(yīng)。腎缺血再灌注損傷72小時(shí)小鼠腎組織免疫組化共染色結(jié)果示Kim-1陽性腎小管上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Ki67,提示AKI后Kim-1陽性腎小管上皮細(xì)胞增生活躍。免疫組化結(jié)果示部分2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎臟囊腫形成,囊腔上皮細(xì)胞共表達(dá)Kim-1及Ki67;4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)區(qū)Kim-1陽性腎小管同時(shí)高度表達(dá)Ki67,提示Kim-1REC-tg小鼠Kim-1陽性上皮細(xì)胞增生活

17、躍。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示2周齡、4周齡、12周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)區(qū)Ki67陽性腎小管上皮細(xì)胞數(shù)均較對照組顯著增加;4周齡Kim-1REC-tg小鼠Ki67陽性腎小球細(xì)胞數(shù)較對照組顯著增加。Realtime-PCR分析結(jié)果示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)PDGF-b及TGF-β表達(dá)水平即出現(xiàn)升高,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)EGF、FGF、PDGF-b、CTGF及TGF-β的表達(dá)均顯著高于對照組,以上結(jié)果提示

18、Kim-1表達(dá)刺激腎皮質(zhì)細(xì)胞大量合成多種生長因子,導(dǎo)致腎組織細(xì)胞增生活躍,腎單位結(jié)構(gòu)功能異常。
　　結(jié)論：
　　1、表達(dá)Kim-1的腎小管上皮細(xì)胞持續(xù)分泌TNF-α等前炎癥因子,誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷徙浸潤,導(dǎo)致進(jìn)行性加重的腎臟炎癥損傷;
　　2、Kim-1介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞合成多種生長因子,導(dǎo)致腎組織細(xì)胞異常增生,腎單位結(jié)構(gòu)和功能異常;
　　3、Kim-1慢性表達(dá)誘導(dǎo)Kim-1REC-tg小鼠腎間質(zhì)持續(xù)炎癥損傷及進(jìn)行性

19、纖維化,提示Kim-1是腎纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。
　　第三部分mTOR信號通路介導(dǎo)Kim-1REC-tg小鼠腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究
　　目的：研究mTOR信號通路在Kim-1慢性表達(dá)致Kim-1REC-tg小鼠腎間質(zhì)纖維化過程中的調(diào)控作用。
　　方法：realtime-PCR及免疫組化方法分析2-5周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)組織mTOR信號通路中各效應(yīng)因子的表達(dá)情況。4周齡Kim-1REC-tg小鼠隨機(jī)分為治

20、療組(n=6)及安慰劑組(n=6),同窩Kim-1陰性小鼠作為空白對照組(n=5),治療組小鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg/day),安慰劑組腹腔注射等量生理鹽水。6周后分別檢測兩組小鼠尿蛋白及血肌酐水平,腎臟組織病理切片評估腎臟損傷程度,western-blot檢測pS6K及αSMA表達(dá)水平,realtime PCR檢測腎組織炎癥因子表達(dá)水平,腎組織免疫組化染色分析腎皮質(zhì)pS6K表達(dá)特點(diǎn)及F4/80陽性細(xì)胞、αSMA陽性細(xì)胞浸潤情況

21、,分別計(jì)數(shù)各組小鼠腎組織中Ki67陽性細(xì)胞及CD3陽性細(xì)胞。
　　結(jié)果：realtime-PCR結(jié)果顯示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)組織AKT、mTOR及e1F4E-BP3的mRNA表達(dá)較同窩對照組顯著增高,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質(zhì)組織中mTOR通路多個(gè)效應(yīng)因子水平均明顯增高。免疫組化分析示4周齡Kim-1REC-tg小鼠大量腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)pS6K,提示Kim-1REC-tg小鼠腎組織mTO

22、R通路顯著激活。雷帕霉素治療6周后,Kim-1REC-tg小鼠尿蛋白及血肌酐水平較對照組明顯降低,腎臟病理學(xué)檢查示治療組小鼠腎小管損傷較對照組明顯減輕。Western blot及免疫組化分析示與對照組相比,治療組小鼠腎組織pS6K及αSMA的表達(dá)水平顯著下調(diào),腎間質(zhì)F4/80陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕,Ki67陽性細(xì)胞及CD3+細(xì)胞數(shù)均較對照組明顯減少,雷帕霉素顯著減輕Kim-1REC-tg小鼠腎臟炎癥損傷及纖維化程度