鴨補(bǔ)體系統(tǒng)的發(fā)育性變化及RA感染的影響.pdf

1、鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨病稱為鴨傳染性漿膜炎，該病呈敗血癥形式，以纖維素性心包炎、肝周炎、腦膜炎、氣囊炎和神經(jīng)癥狀以及部分病例出現(xiàn)干酪樣輸卵管炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎為特征，是養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，至今幾乎存在于所有養(yǎng)鴨地區(qū)。該細(xì)菌的感染，以發(fā)病率和死亡率高、生長(zhǎng)性能下降、肉品質(zhì)量下降、預(yù)防和治療費(fèi)用增加等造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于RA耐藥性嚴(yán)重，菌株的血清型眾多且缺乏交叉免疫保護(hù)，現(xiàn)

2、有免疫接種和抗菌藥物治療措施在生產(chǎn)中的應(yīng)用受到一定的限制。
　　補(bǔ)體（complement，C）系統(tǒng)是人和動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)重要的組分之一,不但是機(jī)體防御病原體的第一道防線,參與清除“危險(xiǎn)信號(hào)”,而且在調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的過(guò)程中也發(fā)揮極其重要的作用。補(bǔ)體活性的高低，是動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)抵抗入侵病原微生物能力大小的標(biāo)志。檢測(cè)補(bǔ)體的單個(gè)成分及補(bǔ)體的活性測(cè)定對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能評(píng)價(jià)，疾病的診斷與治療，流行病學(xué)調(diào)查等均有重要作用。

3、　　本試驗(yàn)選取四川麻鴨為研究對(duì)象，通過(guò)建立鴨疫里默氏菌感染模型來(lái)研究RA感染前后鴨補(bǔ)體活性的變化、C3d基因和CR2基因的mRNA表達(dá)變化及C3d和sCR2蛋白含量的變化，旨在揭示鴨疫里默氏桿菌（RA）感染對(duì)鴨補(bǔ)體系統(tǒng)的影響，為進(jìn)一步研究補(bǔ)體在鴨抗RA感染免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.麻鴨RA感染模型的建立
　　實(shí)驗(yàn)條件下飼喂的10日齡四川麻鴨腿部皮下注射RA菌液0.2mL/只(1×109cfu/mL

4、)，接種后168h內(nèi)發(fā)病率80％、死亡率70%，其中接種后24h出現(xiàn)明顯的臨床癥狀、死亡高峰期在36h~60h。病死鴨解剖表現(xiàn)出全身漿膜及各組織器官的被膜纖維素滲出附著，呈現(xiàn)典型的纖維素性心包炎、肝周炎；心臟、肝臟、脾臟充血腫大。
　　2.麻鴨血清補(bǔ)體活性的變化
　　利用溶血素致敏雞紅細(xì)胞及固定血清稀釋度（1:5）測(cè)定麻鴨血清總補(bǔ)體溶血活性。利用1%兔紅細(xì)胞及固定血清稀釋度（1:5）測(cè)定血清補(bǔ)體旁路途徑溶血活性。麻鴨血清總補(bǔ)

5、體溶血活性1～15d逐漸升高，15～21d趨于穩(wěn)定并接近成年麻鴨；旁路途徑溶血活性1～15d逐漸升高，15～21d趨于穩(wěn)定并接近成年麻鴨。
　　10日齡麻鴨人工感染RA，血清總補(bǔ)體溶血活性在感染后12～24h升高，且高于對(duì)照組；36～48h逐漸降低，48～168h逐漸升高，但都低于對(duì)照組。血清旁路途徑溶血活性在感染后12～48h逐漸降低，48～168h逐漸升高，但都低于對(duì)照組。
　　3.麻鴨C3d、CR2 mRNA表達(dá)的變化

6、
　　根據(jù)Genebank上發(fā)表的鴨C3d基因序列（登錄號(hào)：EU847624.1）、鴨CR2的EST序列（登錄號(hào)：DR765735.1）設(shè)計(jì)引物，分別以肝臟和脾臟提取總RNA為模板建立RT-PCR，克隆測(cè)序得到四川麻鴨C3d和CR2基因片段分別為991bp和347bp。在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)四川麻鴨 C3d基因與綠頭鴨 C3d基因相似性達(dá)99%，四川麻鴨CR2基因與卷羽鵜鶘CR2基因相似性達(dá)90%。
　　依據(jù)已獲得的C3d、C

7、R2基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以鴨β-actin基因作內(nèi)參基因，1日齡作對(duì)照，采用2-△△Ct法進(jìn)行C3d、CR2 mRNA的表達(dá)分析。
　　麻鴨C3d mRNA在1～12d表達(dá)升高，12～21d表達(dá)趨于穩(wěn)定；CR2 mRNA的表達(dá)不規(guī)律，在1.00～2.87倍之間，3、6、9、12、15、18和21d的表達(dá)分別是1d的1.73倍、1.45倍、2.55倍、1.68倍、1.39倍、1.82倍和2.87倍。
　　10日齡麻

8、鴨人工感染RA后，C3d mRNA的表達(dá)12～48h逐漸降低，48～168h逐漸升高，且都低于對(duì)照組；CR2 mRNA的表達(dá)在感染后12～48h逐漸降低，48～168h逐漸升高，且都低于對(duì)照組。
　　4．麻鴨C3d、sCR2蛋白含量的變化
　　根據(jù)鴨C3d ELISA試劑盒和鴨可溶性白細(xì)胞分化抗原21（CR2/sCD21）ELISA試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定麻鴨C3d和sCR2的蛋白含量。
　　麻鴨血清中C3d蛋白含量在1