GHS-R基因敲除對(duì)老年小鼠肥胖和胰島素敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和生活方式的改變,糖尿病已經(jīng)成為一個(gè)全民關(guān)注的重大的公共衛(wèi)生問題。目前我國(guó)20歲以上人群中糖尿病的總體患病率已達(dá)9.7％。糖尿病患病率和年齡密切相關(guān),隨著年齡的增加,糖尿病患病率顯著增加,60歲以上人群已達(dá)到20.4%。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一,而肥胖,尤其是中心性肥胖是胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。
　　 在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)均存在兩種脂肪:白色脂肪組織(White ad

2、iposetissue,WAT)和棕色脂肪組織(Brown adipose tissue,BAT)。白色脂肪組織占體內(nèi)脂肪的絕大多數(shù),廣泛分布于內(nèi)臟周圍和皮下,主要功能是將多余的能量以脂肪的形式儲(chǔ)藏起來,并可通過影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、加強(qiáng)脂肪分解、分泌脂肪細(xì)胞因子如抵抗素、脂聯(lián)素、瘦素、脂源性腫瘤壞死因子α(TNF-α)等多種途徑參與胰島素抵抗的發(fā)病。與之不同的是,棕色脂肪組織含有較少的脂肪顆粒,卻含有大量的線粒體,其特征性蛋白解偶聯(lián)蛋白

3、1(uncouplingprotein1,UCP1)位于線粒體內(nèi)膜,參與調(diào)控ATP合成和氧化磷酸化解偶聯(lián)過程,與機(jī)體產(chǎn)熱功能和能量代謝調(diào)控密切相關(guān)。
　　 過去認(rèn)為,棕色脂肪組織主要存在于新生兒和幼小的冬眠哺乳動(dòng)物體內(nèi),在成年人或成年動(dòng)物體內(nèi),棕色脂肪組織已經(jīng)基本消失。近來的幾項(xiàng)研究均證實(shí)棕色脂肪組織同樣存在于正常成年人體內(nèi)。衰老過程通常伴隨著嚴(yán)重的棕色脂肪含量降低和產(chǎn)熱功能減退。研究顯示,與青年男性相比較,老年男性棕色脂肪組織

4、含量減少95%,而活性下降了75%。產(chǎn)熱作用調(diào)節(jié)異常能降低能量消耗,影響能量平衡,促進(jìn)肥胖的發(fā)生。因此,棕色脂肪組織可能在衰老時(shí)機(jī)體能量代謝和脂肪代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但是目前對(duì)于棕色脂肪與衰老和能量代謝相關(guān)的分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　 Ghrelin是一種由28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子多肽,是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體。目前已經(jīng)證

5、實(shí)ghrelin刺激生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)釋放、促進(jìn)食欲和增加體重的作用是通過其受體GHS-R實(shí)現(xiàn)的。本項(xiàng)目組的既往研究發(fā)現(xiàn),與同年齡的野生型小鼠相比,10-13月齡的GHS-R基因敲除(Ghsr-/-)小鼠能量消耗顯著增高,但這種差異在青年小鼠(2-4月齡)并未檢測(cè)到。這說明GHS-R對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié)可能與年齡有關(guān)。
　　 采用基因敲除辦法抑制瘦素基因缺陷的ob/ob小鼠ghrelin基因表達(dá)后,ob/

6、ob小鼠高血糖情況得到明顯改善,葡萄糖刺激的胰島素分泌明顯增加,其機(jī)制是降低胰腺解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)胰腺胰島素的分泌。Ob/ob小鼠給予GHS-R拮抗劑注射后,血糖和血漿胰島素水平明顯下降,胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)得到改善。青年Ghsr-/-小鼠食欲正常,體重和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)水平輕度下降。此外,給予Ghsr-/-小鼠能量攝入控制干預(yù)(每日食物供給量為正常攝食量的50%)后,其血糖和胰島素水平均明顯降低。因此,

7、Ghrelin-GHS-R信號(hào)通路可能在肥胖和糖尿病發(fā)病中起重要作用。
　　 目的：本研究通過對(duì)18-26月齡的老年Ghsr-/-小鼠與野生型小鼠能量代謝、脂代謝以及胰島素敏感性等方面的比較,了解GHS-R基因?qū)λダ蠒r(shí)肥胖和胰島素敏感性的影響,并探討相關(guān)的分子機(jī)制;通過觀察ghrelin及GHS-R拮抗劑對(duì)小鼠棕色脂肪HIB1B細(xì)胞脂肪生成及產(chǎn)熱功能相關(guān)基因表達(dá)的影響,了解ghrelin-GHS-R信號(hào)通路對(duì)棕色脂肪細(xì)胞脂代謝和

8、產(chǎn)熱反應(yīng)的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1.選擇年齡在3-6月齡的GHS-R雜合子小鼠,再次確定基因型無誤后建立小鼠繁殖籠,將產(chǎn)生的雌性子鼠以CO2深度麻醉的方式處死,留取雄性子鼠進(jìn)行基因型分析,以純合子(Ghsr-/-)小鼠作為實(shí)驗(yàn)組,以年齡具有可比性的野生型(+/+)小鼠作為對(duì)照組,均飼以常規(guī)小鼠飼料。選取2月齡,3月齡和4月齡的小鼠作為青年組,18月齡,20月齡,22月齡,24月齡和26月齡的小鼠作為老年組。此外

9、,隨機(jī)選取8-10只野生型小鼠,從出生后4周起飼以高脂飼料(42%能量來源于脂肪)。
　　 2.小鼠身體組成成分分析采用Lunar PIXImus密度測(cè)量?jī)x和雙能X線吸收測(cè)量?jī)x。所有圖像分析均采用呼吸門控法。每只小鼠均采集至少20幀冠狀面圖像和20幀軸狀面圖像。此外,所有小鼠均采用Echo MRI-100儀器進(jìn)行磁共振(MRI)分析,通過全身掃描得到小鼠體脂含量(fat mass)和瘦體質(zhì)(lean mass)含量結(jié)果,并計(jì)算其

10、與體重的比值(%)。每只小鼠至少檢測(cè)三次,取其均值進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。
　　 3.小鼠空腹過夜,自由飲水。早晨11點(diǎn)之前完成血液標(biāo)本采集,離心后保存血清和/或血漿。分別采用氧化酶法測(cè)定血漿膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL);采用放射免疫法(RIA)測(cè)定空腹血清瘦素(Leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素(resistin)以及胰島素水平;血漿游離脂肪酸(FFA

11、)測(cè)定采用酶法;血清T3、T4測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(EIA)。
　　 4.胰島素耐量實(shí)驗(yàn):分別對(duì)2-4月齡及18-26月齡Ghsr-/-小鼠與野生型小鼠禁食不禁水6 h,測(cè)定基礎(chǔ)血糖值,按0.75-1.0 U/kg的劑量腹腔注射常規(guī)胰島素溶液,記錄注射后30,60,90和120 min血糖值。
　　 5.葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn):分別對(duì)2-4月齡及18-26月齡Ghsr-/-小鼠與野生型小鼠禁食不禁水18 h,測(cè)定基礎(chǔ)血糖值

12、并取血50μl,按2.0-2.5 g/kg的劑量腹腔注射20%葡萄糖溶液,記錄注射后15 min,30 min,60min和120 min的血糖值,并取血50μl-20℃低溫保存以備胰島素水平測(cè)定。
　　 6.采用開放式Oxymax間接測(cè)熱系統(tǒng)(indriect calorimetry system)采集并分析小鼠代謝指標(biāo),評(píng)估小鼠的整體代謝狀況。主要測(cè)量及計(jì)算指標(biāo)包括24h氧氣消耗量(VO2)、二氧化碳生成量(VCO2)、能量

13、消耗(Energyexpenditure,or Heat)、呼吸商(RQ)、靜息能量代謝率(RMR)、累積相對(duì)頻率百分比(PRCF)以及自主活動(dòng)(locomotor activity)等。
　　 7.處死22月齡Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠,分離并摘取附睪周圍脂肪(白色脂肪組織)和肩胛間區(qū)棕色脂肪組織。將組織浸泡于10%甲醛溶液中固定過夜,脫水處理后石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚度為5μm,進(jìn)行蘇木素&伊紅(H&E)染色。

14、　　 8.光學(xué)顯微鏡下測(cè)量附睪周圍脂肪切片上脂肪細(xì)胞的直徑和面積,并按公式計(jì)算脂肪細(xì)胞體積;測(cè)定整片附睪周圍脂肪中甘油三酯含量,按公式推算脂肪細(xì)胞的數(shù)目。
　　 9.利用Trizol試劑提取小鼠附睪周圍脂肪組織和棕色脂肪組織的總RNA,采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GHS-R mRNA的表達(dá),并對(duì)與脂肪代謝及產(chǎn)熱反應(yīng)密切相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析;提取高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和基因缺陷導(dǎo)致的肥胖ob/ob小鼠脂

15、肪組織總RNA,分別檢測(cè)GHS-R及UCP1 mRNA的表達(dá)。
　　 10.提取Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠棕色脂肪組織總蛋白,利用免疫印跡分析法(Western blot)觀察UCP1蛋白表達(dá)的變化。
　　 11.分別提取Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠棕色脂肪組織中線粒體DNA和核DNA,并進(jìn)行定量,計(jì)算線粒體DNA與核DNA的比值。
　　 12.將小鼠從動(dòng)物房轉(zhuǎn)移至4℃,4 h后移回動(dòng)物房,分別測(cè)定小鼠室溫

16、下、4℃1h,4℃2 h,4℃3 h,4℃4 h以及室溫恢復(fù)2 h后的直腸溫度。
　　 13.利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)明確GHS-R在小鼠棕色脂肪細(xì)胞HIB1B中的表達(dá)后,將培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的HIB1B前脂肪細(xì)胞分為以下幾組:對(duì)照組(生理鹽水),0.01 nM ghrelin組,1 nMghrelin組,1μM[D-Lys3]-GHRP-6組,1μM[D-Lys3]-GHRP-6+1 nMgh

17、relin組。誘導(dǎo)分化的第0天,HIB1B細(xì)胞換用分化培養(yǎng)液培養(yǎng),第2天,第4天,第6天分別換用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組中加入上述相應(yīng)的化學(xué)藥品共同孵育。分化第7天,以1μM異丙腎上腺素刺激細(xì)胞6 h后收獲細(xì)胞待用。提取細(xì)胞總RNA,利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定PPARγ2、C/EBPα、UCP1以及PGC1αmRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.2-3月齡的Ghsr-/-小鼠體重與野生型小鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)

18、學(xué)意義(p>0.05)。從出生后第4個(gè)月到第20個(gè)月,Ghsr-/-小鼠的體重持續(xù)比同齡野生型小鼠減輕10.15%(p<0.05),從22月齡至26月齡,兩組小鼠體重的差異更為顯著(p<0.01)。與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠(18-22月齡)體內(nèi)脂肪含量降低約35%,瘦體質(zhì)含量增加約10%。MRI掃描結(jié)果也顯示,與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠腹內(nèi)脂肪及皮下脂肪均顯著減少。
　　 2.與野生型小鼠相比,老年

19、Ghsr-/-小鼠(18月齡)空腹血清瘦素水平顯著降低(p<0.05),而血清脂聯(lián)素和抵抗素水平無顯著差異(p>0.05)。與空腹6小時(shí)相比,兩組小鼠空腹18小時(shí)的血漿FFA水平均增高。此外,空腹18小時(shí)后,Ghsr-/-小鼠血漿FFA水平較野生型小鼠明顯降低(p<0.05)。老年Ghsr-/-小鼠空腹血漿甘油三酯(TG),低密度脂蛋白(LDL)及極低密度脂蛋白(VLDL)水平均較野生型小鼠顯著降低(p<0.05),而膽固醇(TC)及高

20、密度脂蛋白(HDL)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。無論在空腹或飽食狀態(tài)下,Ghsr-/-小鼠與野生型小鼠血清T3和T4水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 3.胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青年Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠葡萄糖下降速度相似,均表現(xiàn)為胰島素敏感,兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。隨著小鼠衰老程度加重,野生型小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的胰島素抵抗;與之相反的是,在18、20、24及26月齡,Ghsr

21、-/-小鼠均表現(xiàn)為對(duì)胰島素相對(duì)敏感,其反應(yīng)曲線與青年小鼠相似。
　　 4.葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予葡萄糖負(fù)荷后,青年Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠表現(xiàn)為相似的血糖下降速度,但Ghsr-/-小鼠的胰島素水平顯著低于對(duì)照組小鼠(p<0.05)。隨著小鼠的衰老,Ghsr-/-小鼠在葡萄糖負(fù)荷60 min以及120 min后血糖下降速度顯著快于野生型小鼠,并且Ghsr-/-小鼠胰島素分泌水平低于對(duì)照組(p<0.05)。
　　

22、 5.與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠晝夜氧氣消耗量(VO2)和二氧化碳生成量(VCO2)均顯著增加(p<0.001)。經(jīng)瘦體質(zhì)含量(lean mass)校正的能量消耗(以熱量表示,heat)也始終高于野生型小鼠(p<0.01)。老年Ghsr-/-小鼠經(jīng)體重或者瘦體質(zhì)含量校正的靜息代謝率均高于野生型小鼠(p<0.05或p<0.01)。Ghsr-/-小鼠的晝夜呼吸商(RQ)均顯著高于野生型小鼠(p<0.001)。累積相對(duì)頻率曲線提

23、示,老年Ghsr-/-小鼠的呼吸商變化范圍更寬廣。
　　 6.H&E染色結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠附睪周圍脂肪組織的脂肪細(xì)胞較小,定量分析結(jié)果顯示,Ghsr-/-小鼠小脂肪細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目較多,大脂肪細(xì)胞相對(duì)數(shù)目較少。野生型小鼠脂肪細(xì)胞的平均大小為9,316μm2,而Ghsr-/-小鼠脂肪細(xì)胞的平均大小為5,113μm2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。兩組小鼠脂肪細(xì)胞的數(shù)目無顯著差別(p>0.05)。

24、
　　 7.白色脂肪組織基因分析結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,Ghsr-/-小鼠調(diào)控葡萄糖攝取及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子GLUT4、LPL及CD36表達(dá)均顯著降低(p<0.001);參與脂肪形成的關(guān)鍵因子aP2、FAS、Lipin1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(p<0.001);調(diào)控脂肪細(xì)胞形成與分化的關(guān)鍵因子PPARγ2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(p<0.05),而C/EBPα mRNA表達(dá)水平無變化(p>0.05);調(diào)控脂肪分解的關(guān)鍵酶

25、Perilipin和HSL的表達(dá)水平均降低(p<0.05);此外,Ghsr-/-小鼠PEPCK mRNA表達(dá)顯著降低(p<0.001),UCP2以及ABCG1 mRNA的表達(dá)水平均無顯著變化(p>0.05)。
　　 8.青年Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠UCP1 mRNA表達(dá)水平無顯著差別(p>0.05)。隨著年齡的增長(zhǎng),老年野生型小鼠UCP1 mRNA表達(dá)水平降低,與之相反的是,老年Ghsr-/-小鼠與青年Ghsr-/-小鼠U

26、CP1 mRNA表達(dá)水平相似。此外,老年Ghsr-/-小鼠和同年齡野生型小鼠UCP1 mRNA表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。免疫印跡分析結(jié)果也提示,與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠UCP1蛋白表達(dá)水平顯著增高(p<0.05)。DNA定量分析結(jié)果顯示,Ghsr-/-小鼠棕色脂肪組織中線粒體DNA與核DNA的比值增高(p<0.05)。
　　 9.老年Ghsr-/-小鼠的直腸溫度顯著高于野生型小鼠(p<0.05

27、),正常室溫條件下,兩組小鼠直腸溫度的差值是0.67℃,當(dāng)外界溫度轉(zhuǎn)為4℃后,兩組小鼠直腸溫度差值逐漸增加,4 h后,Ghsr-/-小鼠和野生型小鼠直腸溫度的差異達(dá)到3.50℃。
　　 10.棕色脂肪組織基因定量分析結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,老年Ghsr-/-小鼠PGC1α mRNA表達(dá)水平增高,但其差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.08);GLUT4,LPL,CD36 mRNA表達(dá)水平顯著增高(p<0.05或p<0.001);a

28、P2,Lipinl的表達(dá)也增高(p<0.05或p<0.001),FAS mRNA表達(dá)水平無顯著差異(p>0.05);以上結(jié)果提示,Ghsr-/-小鼠棕色脂肪組織將葡萄糖和脂肪轉(zhuǎn)化后用于產(chǎn)熱反應(yīng)的能力增強(qiáng)。PPARγ2和C/EBPαmRNA表達(dá)均增高,但兩組比較僅有C/EBPα的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);Perilipin mRNA表達(dá)顯著增高(p<0.05),但HSL的表達(dá)無變化(p>0.05)。
　　 11.在未

29、分化(day0)和分化的(day2,day4,day6)HIB1B細(xì)胞中均有GHS-R mRNA的表達(dá)。HIB1B細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,不論是0.01 nM或1nM的ghrelin處理組PPARγ2和C/EBPa mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(p<0.05或p<0.01),并且1 nM ghrelin能顯著抑制HIB1B細(xì)胞PGC1α和UCP1mRNA的表達(dá)水平(p<0.05或p<0.01)。1μM GHS-R抑制劑[D-Lys3]-GHRP-6

30、能顯著提高HIB1B細(xì)胞UCP1 mRNA的表達(dá)(p<0.01),并上調(diào)HIB1B細(xì)胞PPARγ2 mRNA的表達(dá)(p<0.05)。此外,1μM[D-Lys3]-GHRP-6能阻斷1 nM ghrelin對(duì)PPARγ2、C/EBPα、PGC1α和UCP1mRNA表達(dá)的抑制作用。
　　 12.高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和瘦素基因缺陷的肥胖ob/ob小鼠白色脂肪組織中GHS-R mRNA表達(dá)水平與常規(guī)飼料喂養(yǎng)的小鼠無顯著差異(p>0.0

31、5)。高脂肥胖小鼠棕色脂肪組織中飲食誘導(dǎo)的UCP1 mRNA表達(dá)水平增加(p<0.001),但GHS-R mRNA水平與常規(guī)飼料喂養(yǎng)的小鼠并無顯著區(qū)別(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.野生型青年小鼠脂肪組織GHS-R mRNA不表達(dá),老年小鼠GHS-RmRNA持續(xù)低水平表達(dá),提示GHS-R對(duì)脂肪代謝的調(diào)控作用可能與年齡有關(guān)。
　　 2.GHS-R基因敲除能降低老年小鼠體重及體脂含量,增高胰島素敏感性。<