蘚化飲治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變前后HSP90α、Ki-67的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：口腔黏膜癌前病變是發(fā)生口腔癌的潛在惡性病變，近年來(lái)有發(fā)病率上升的趨勢(shì)，及時(shí)的預(yù)防和治療口腔黏膜癌前病變顯得尤為重要?？谇徽衬ぐ┣安∽兊牟∫蝈e(cuò)綜復(fù)雜，癌變機(jī)理尚待明確。近年來(lái)隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，口腔黏膜癌前病變發(fā)病機(jī)理研究取得一定進(jìn)展。目前，研究主要集中在口腔黏膜癌前病變與細(xì)胞凋亡及增殖、周期調(diào)控紊亂關(guān)系的研究上。Ki67抗原是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的增殖細(xì)胞核蛋白。Ki67高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)志。HSP90α受體

2、蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡路徑有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)、維持細(xì)胞的穩(wěn)定有重要的作用，而且在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。HSP90α和Ki-67的表達(dá)可以作為癌前病變的早期診斷和用來(lái)作為對(duì)藥物治療癌前病變療效評(píng)定的生物學(xué)指標(biāo)。
　　 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥治療口腔黏膜癌前病變顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。我們?cè)谝酝呐R床實(shí)踐中應(yīng)用中藥蘚化飲治療口腔黏膜癌前病變收到較好的治疔效果。為了深入研究

3、中藥蘚化飲的確切作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變動(dòng)物模型，采用免疫組化方法觀察中藥蘚化飲治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變前后HSP90α、Ki-67的表達(dá)，分析探討中藥蘚化飲對(duì)口腔黏膜癌前病的逆轉(zhuǎn)作用，為今后臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1建立動(dòng)物頰黏膜癌前病變模型選取SPF級(jí)LVG敘利亞金黃地鼠55只，鼠齡六周，體質(zhì)量80g。按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法將動(dòng)物分為：空白對(duì)照組5只和實(shí)驗(yàn)組50只。實(shí)驗(yàn)組用于建

4、立口腔黏膜癌前病變動(dòng)物模型，其中又分為癌前病變對(duì)照組10只、蘚化飲治療組30只、生理鹽水治療對(duì)照組10只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，與其余組一同處死。將實(shí)驗(yàn)組50只動(dòng)物，頰囊黏膜涂以0.5％DMBA丙酮溶液，涂藥后禁食禁水2小時(shí)，每周3次，連續(xù)涂藥6周。癌前病變對(duì)照組、蘚化飲治療組、生理鹽水治療對(duì)照組分別涂致癌劑6周后正常飼養(yǎng)、中藥蘚化飲灌胃、生理鹽水灌胃治療8周后處死。
　　 2動(dòng)物標(biāo)本取材1％戊巴比妥鈉溶液腹腔注

5、射處死動(dòng)物后立即取材，取材部位選擇在頰囊前外側(cè)、雙側(cè)頰囊黏膜分別切取約1.0cm×1.5cm×0.1cm大小病變組織及相鄰的部分正常組織。標(biāo)本10％甲醛溶液固定。
　　 3免疫組化染色法檢測(cè)各組中HSP90α、Ki-67的表達(dá)根據(jù)SP免疫組化染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。以PBS代替第一抗體的正?？谇火つど掀そM織免疫組化染色結(jié)果作陰性對(duì)照。用免疫組化染色法檢測(cè)各組中HSP90α、Ki-67的表達(dá)情況，并分析對(duì)比各組之間的差異。Ki67染色

6、評(píng)估以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，HSP90α染色評(píng)估以細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量積分法，將染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無(wú)著色計(jì)為0分；淡黃色計(jì)為1分；棕黃色計(jì)為2分：棕褐色計(jì)為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分5級(jí)：小于5％計(jì)為0分；5％-25％計(jì)為1分；26％-50％計(jì)為2分；51％-75％計(jì)為3分；大于75％計(jì)為4分。每張切片最后的得分為兩次評(píng)分相加所得的總分，按照：0-1分計(jì)為(-)；2-3分計(jì)為(+)；4-5分計(jì)為(

7、++)；6-7分計(jì)為（++）。以（-）定位陰性，以(+)、(++)、（+++）分別定位弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性。
　　 所有資料應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.空白對(duì)照組地鼠頰囊黏膜表面光滑.呈淡粉色，透亮具有彈性，血管清晰，鏡下觀察為角化的復(fù)層鱗狀上皮，上皮和肌層之間為薄層結(jié)締組織及少量散在的纖維細(xì)胞和血管。DMBA丙酮溶液六周后，實(shí)驗(yàn)組50只動(dòng)物雙

8、側(cè)頰黏膜肉眼觀全部為充血、糜爛、條索狀皺折等表現(xiàn)。隨機(jī)切取10例不同肉眼表現(xiàn)的部分病變部位，HE染色后鏡下觀察地鼠頰黏膜可見(jiàn)不同程度的異常增生，表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)異常，上皮分層不規(guī)則，基底細(xì)胞極性喪失，滴狀釘突，核分裂數(shù)增加，異常的淺層分裂，單個(gè)細(xì)胞成熟前角化（錯(cuò)角化）及釘突內(nèi)出現(xiàn)角化珠等。說(shuō)明經(jīng)DMBA丙酮溶液致癌六周后，已成功建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變的動(dòng)物模型。
　　 2.蘚化飲治療后HSP90α、Ki-67在各組免疫組化染色

9、結(jié)果HSP90α陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞核或細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀。Ki-67陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。癌前病變對(duì)照組HSP90α、Ki-67的表達(dá)高于空白對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05)；癌前病變對(duì)照組HSP90α、Ki-67的表達(dá)高于蘚化飲治療組，有顯著性差異(P＜0.05)；生理鹽水治療對(duì)照組HSP90α、Ki-67的表達(dá)高于蘚化飲治療組，有顯著性差異(P＜0.05)；而蘚化飲治療組HSP90α、Ki-67表達(dá)率與空白對(duì)照組

10、，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩指標(biāo)表達(dá)具有相關(guān)性，表達(dá)吻合度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用DMBA成功建立金黃地鼠頰黏膜癌前病變動(dòng)物模型2.HSP90α、Ki-67在正常口腔黏膜有少量表達(dá)，在口腔黏膜癌前病變組織中明顯表達(dá)。應(yīng)用中藥蘚化飲對(duì)口腔黏膜癌前病變進(jìn)行治療干預(yù)后，HSP90α、Ki-67的表達(dá)較治療前降低。
　　 3.中藥蘚化飲對(duì)DMBA誘發(fā)的金黃地鼠口腔黏