哈茨木霉菌PAF-AH-like和hyd1基因系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米抗彎孢葉斑病機(jī)理研究.pdf

1、玉米彎孢葉斑病是我國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，通過(guò)生物防治技術(shù)系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米免疫反應(yīng)，抵抗葉斑病菌侵染，是實(shí)現(xiàn)玉米病害綠色防控的重要途徑。木霉菌分布廣泛，已普遍用于植物病害的生物防治，但關(guān)于木霉菌處理種子或根系系統(tǒng)誘導(dǎo)寄主對(duì)地上部病害的抗性分子機(jī)理國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，尤其關(guān)于木霉菌產(chǎn)生的MAMPs(microbial-associated molecular patterns)分子及其與玉米根系受體互作分子模式尚屬空白。本研究首先成功克隆來(lái)自哈

2、茨木霉菌（Trichoderma harzianum）磷脂酶 A2超家族成員類(lèi)血小板激活因子乙酰水解酶基因（Platelet-activating factor acetylhydrolase like gene，PAF-AH-like gene），原核表達(dá)分析明確了PAF-AH酶活性，其最適pH為6，并且活性不依賴Ca2+。該基因定位于木霉菌細(xì)胞質(zhì)，與木霉菌拮抗立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）及根系特異互作有關(guān)。同時(shí)

3、證明了 PAF-AH-like通過(guò)調(diào)控玉米葉片茉莉酸/乙烯通路相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)了玉米抗彎孢葉斑病的作用。
　　為證實(shí)木霉菌系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米抗葉斑病的MAMPs模式，本研究從哈茨木霉菌克隆獲得一個(gè)II類(lèi)疏水蛋白hyd1基因，發(fā)現(xiàn)其定位在木霉菌的細(xì)胞膜上，具有分泌到胞外的功能、并促進(jìn)了木霉菌對(duì)玉米根系定殖，同時(shí)證明了該蛋白能在根系細(xì)胞膜上表達(dá)，說(shuō)明hyd1與調(diào)控木霉菌定殖玉米根系有密切關(guān)系，為Hyd1作為MAMPs分子與玉米根系互作誘導(dǎo)

4、玉米對(duì)葉斑病的抗性提供前提條件。hyd1基因不同的轉(zhuǎn)化子處理玉米自交系B73種子，四葉期離體和活體葉片挑戰(zhàn)接種彎孢葉斑病菌(Curvularia lunata)，結(jié)果表明：hyd1敲除突變株KO16處理植株葉片的病斑明顯比野生型處理的病斑面積大，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子OE3和OE5病斑面積最小，且差異顯著，證明了hyd1具有系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性的作用。為了從玉米根系篩選響應(yīng)或識(shí)別木霉菌Hyd1的互作蛋白，通過(guò)酵母雙雜交的方法篩選到與Hyd1互作的玉米根系

5、Ubiquilin1-like蛋白，并采用BiFC和pull down方法證明了兩者發(fā)生了直接互作。在酵母菌內(nèi)確定了Ubiquilin1-like與Hyd1互作的區(qū)域，Hyd1的信號(hào)肽序列是其與Ubiquilin1-like-N互作所必需的，并發(fā)現(xiàn)Hyd1中8個(gè)半胱氨酸也參與了上述互作過(guò)程。為了進(jìn)一步證明hyd1和ubiquilin1-like基因是否存在協(xié)同增加植物抗病性的作用，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法，明確了hyd1與ubiquilin1-l

6、ike在擬南芥中共表達(dá)后能明顯促進(jìn)擬南芥對(duì)灰霉病的抗性，轉(zhuǎn)基因植株葉片病斑面積僅為野生型的50%。而且通過(guò)煙草細(xì)胞系證明了Hyd1與Ubiquilin1-like蛋白定位在細(xì)胞膜上，并且Hyd1能提高Ubiquilin1-like蛋白的穩(wěn)定性。通過(guò)RNA-seq全局分析了葉片挑戰(zhàn)接種24 h后木霉菌hyd1調(diào)控寄主防御反應(yīng)的變化，結(jié)果表明，主要通過(guò)油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抗病性，此通路很多

7、基因差異表達(dá)接近3倍。初步用BANK1-4突變體驗(yàn)證表明，hyd1很可能是通過(guò)BAK1進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生抗病性。同時(shí)hyd1也與JA/ET信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，鈣調(diào)蛋白（CaM）及WRKY的一些基因也發(fā)生了變化。根據(jù)上述研究，推測(cè)哈茨木霉菌系統(tǒng)誘導(dǎo)玉米抗彎孢葉斑病的MAMPs模式：哈茨木霉菌在玉米根系分泌的Hyd1與根系類(lèi)受體蛋白Ubiquilin1-like互作，而Ubiquilin1-like可能與油菜素內(nèi)酯受體BAK1互作一起形成復(fù)合物導(dǎo)