玉米彎孢葉斑病菌的熒光標(biāo)記及其對(duì)玉米侵染過程的研究.pdf

1、由新月彎孢(Curvularia lunata(Wakker)Boed.)引起的玉米彎孢葉斑病是近年來我國(guó)北方玉米主產(chǎn)區(qū)流行的一種重要葉部病害。自20世紀(jì)70年代未80年代初在我國(guó)遼寧沿海地區(qū)發(fā)生此病以來，已不斷向其它地區(qū)擴(kuò)展漫延為害，對(duì)玉米生產(chǎn)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于玉米致病彎孢菌的致病性分化、致病機(jī)制等方面已有較多研究，但對(duì)該病菌在玉米葉片上的侵染及發(fā)育過程仍不十分清楚。
　　 本文采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法發(fā)將熒光蛋白基因(DsRe

2、d和gfp)轉(zhuǎn)入新月彎孢C。lunata95-1菌株，通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的致病性狀等分析篩選獲得與野生型菌株差異最小的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)分析。主要結(jié)論如下：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法能夠?qū)sRed和GFP熒光蛋白標(biāo)記基因隨機(jī)插入新月彎孢的基因組內(nèi)，且外源基因插入都為單拷貝。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行致病性狀等指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)DsRed更易引起突變體的出現(xiàn)。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)gfp基因的新月彎孢菌株，利用熒光顯微鏡觀察其在玉米抗病和感病自交系葉部系統(tǒng)的侵染過程。親和互作中

3、，接種2 h后分生孢子即可萌發(fā)，6 h分生孢子的萌發(fā)率可達(dá)到90％，分生孢子萌發(fā)一般會(huì)產(chǎn)生1個(gè)芽管，少數(shù)會(huì)產(chǎn)生雙芽管，芽管生長(zhǎng)速度快且不斷產(chǎn)生分枝及附著結(jié)構(gòu)；24～48 h能夠觀察到侵染絲從表皮直接侵入進(jìn)寄主細(xì)胞，侵染菌絲在細(xì)胞間迅速擴(kuò)展，侵染絲在穿透寄主細(xì)胞壁時(shí)菌絲會(huì)有明顯變細(xì)的現(xiàn)象；胞內(nèi)菌絲形成后，寄主細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞變形成了空腔，后期時(shí)整個(gè)細(xì)胞塌陷壞死；120 h時(shí)病原菌穿過壞死的柵欄組織和表皮細(xì)胞中伸出，形成分生孢子梗

4、并產(chǎn)生分生孢子，葉片出現(xiàn)明顯的組織壞死。非親和互作中，48 h也能夠觀察到侵染絲從表皮侵入寄主，抗病材料犧牲局部細(xì)胞，阻止病原菌進(jìn)一步侵染與擴(kuò)展；96 h時(shí)寄主產(chǎn)生的病斑小且少。
　　 用RT-PCR的方法分析了新月彎孢侵染玉米抗、感自交系后防御相關(guān)因子的變化規(guī)律。結(jié)果表明：病原菌侵染12～48 h時(shí)，抗感材料中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、病程相關(guān)蛋白(PR-1、PR-10)等防御相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，抗病材料中誘導(dǎo)防御相關(guān)

5、基因的表達(dá)時(shí)間早于感病材料，誘導(dǎo)的表達(dá)量大于感病材料。與茉莉酸信號(hào)途徑有關(guān)的抗病相關(guān)基因脂氧合酶(LOX)在抗感材料中的轉(zhuǎn)錄水平無變化。抗病材料出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)間較感病材料早，推測(cè)抗病材料早期細(xì)胞凋亡是寄主本身抗性的反應(yīng)。
　　 對(duì)441份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行了抗彎孢葉斑病鑒定，共篩選出表現(xiàn)高抗玉米材料8份(京05、選6、運(yùn)42291、黃5、赤黃32、自3303、37、5003)，高抗、抗、中抗、感和高感的比例分別為1.81％、12.