促覺醒肽orexin-A和穩(wěn)態(tài)因子腺苷調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)嗅皮層淺層主要神經(jīng)元興奮性及其機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)嗅皮層(entorhinal cortex,EC)被認(rèn)為是海馬與其它皮層之間纖維聯(lián)系的門戶,其淺層的主要神經(jīng)元--星形神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元接受皮層的纖維投射并通過不同的路徑向海馬傳遞信息,Ⅱ?qū)有切紊窠?jīng)元的軸突形成穿通路支配海馬齒狀回和CA3區(qū),而Ⅲ層錐體神經(jīng)元通過TA通路與海馬CA1區(qū)和下托的錐體神經(jīng)元的遠(yuǎn)端樹突形成突觸聯(lián)系。EC不僅在新皮層一海馬一新皮層記憶環(huán)路中處于重要解剖位置,還與空間學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固密切相關(guān)。眾所周知,認(rèn)知功

2、能的完成依賴于良好的覺醒狀態(tài)。促覺醒肽orexins(又稱hypocretins)是由外側(cè)下丘腦區(qū)特定神經(jīng)元亞群分泌的一類小分子神經(jīng)肽。Orexin系統(tǒng)包括來源于同一前體分子的兩個(gè)單體orexin-A和orexin-B以及兩種特異的G-蛋白偶聯(lián)受體orexin受體1(orexin receptor1,OX1R)和orexin受體2(orexin receptor2,OX2R)。Orexins在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous

3、 system,CNS)具有廣泛的興奮作用,通過不同的離子信號(hào)機(jī)制和突觸機(jī)制調(diào)節(jié)多個(gè)腦區(qū)不同類型神經(jīng)元的興奮性,進(jìn)而影響相關(guān)腦區(qū)功能。腺苷是CNS內(nèi)的一種能量代謝產(chǎn)物,隨著神經(jīng)元活動(dòng)的增加而逐漸在腦內(nèi)積聚。與orexins的作用相反,腺苷在CNS中具有廣泛的抑制作用。我們推測(cè)正常覺醒狀態(tài)下EC認(rèn)知功能的維持和延長覺醒狀態(tài)下:EC認(rèn)知功能的下降與EC的orexins和腺苷水平及其對(duì)EC神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān),但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。<

4、br>　　 本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞腦片膜片鉗記錄技術(shù),選擇ECⅡ-Ⅲ層主要神經(jīng)元(星形神經(jīng)元和錐體神經(jīng)元)為研究對(duì)象,首先觀察促覺醒肽orexin-A對(duì)EC淺層主要神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)效應(yīng),然后進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的可能離子通道機(jī)制、信號(hào)通路機(jī)制和突觸機(jī)制,最后再初步分析穩(wěn)態(tài)因子腺苷對(duì)EC淺層主要神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)作用。結(jié)果如下:
　　 1.Orexin-A通過抑制持續(xù)K+通道同時(shí)激活非選擇性陽離子通道突觸后興奮EC淺層主要神經(jīng)元

5、r>　　 在灌流的ACSF中加入1μMTTX和5 mM的4-AP分別阻斷電壓門控Na+通道和瞬時(shí)K+通道,電壓鉗模式下,給與細(xì)胞躍階電壓刺激(-60 mV～+40 mV,+20 mV,step,0.5 s)分離出持續(xù)K+電流,應(yīng)用orexin-A后記錄神經(jīng)元的持續(xù)K+電流明顯減小(n=8)。上述結(jié)果表明:orexin-A抑制EC淺層主要神經(jīng)元的持續(xù)K+通道提高其興奮性。
　　 在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻斷電壓門控N

6、a+通道,電壓鉗模式下,先將記錄神經(jīng)元鉗制在-100 mV,持續(xù)0.5 s,再給與記錄神經(jīng)元慢電壓ramp刺激[-100 mV～0 mV(10 s)],應(yīng)用100 nM orexin-A后誘發(fā)出差異電流(n=6)。Orexin-A誘發(fā)電流的平均值在檢測(cè)電壓范圍內(nèi)成一條直線(r2=0.99),表明通道的激活不是電壓依賴的,并且其平均反轉(zhuǎn)電位為-41.8±4.8 mV,這正符合非選擇性陽離子電流激活的特點(diǎn)。結(jié)果提示:orexin-A激活EC

7、淺層主要神經(jīng)元的非選擇性陽離子通道。
　　 另外,我們還檢測(cè)了orexin-A對(duì)超極化激活的陽離子通道、G-蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流K+通道、電壓門控Ca2+通道和生電性Na+/Ca2+交換泵的影響,均為陰性結(jié)果。
　　 2.Orexin-A激活OX1Rs通過PKC信號(hào)通路發(fā)揮突觸后興奮效應(yīng)
　　 灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻斷OX1Rs,在電流鉗模式下,給與100 nMorexin-A1～2 min,

8、orexin-A誘發(fā)神經(jīng)元膜電位去極化的作用消失。結(jié)果表明,在ECorexin-A的興奮效應(yīng)是通過OX1Rs來發(fā)揮的。
　　 將腦片在含1μM BIS-Ⅱ的ACSF中至少孵育2 h,并對(duì)BIS-Ⅱ采取長時(shí)間循環(huán)灌流給藥。結(jié)果顯示:在BIS-Ⅱ存在的情況下,orexin-A去極化神經(jīng)元的作用消失,并且orexin-A抑制持續(xù)K+電流(n=8)和激活非選擇性陽離子電流(n=9)的效應(yīng)也消失。結(jié)果表明:PKC信號(hào)通路參與了orexin

9、-A興奮EC淺層主要神經(jīng)元的作用。
　　 3.Orexin-A通過OX1Rs增強(qiáng)EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞
　　 在灌流ACSF中分別加入10μM荷包牡丹堿阻斷離子通道型GABAA受體,或者10μM CNQX和50μM AP-V阻斷離子通道型谷氨酸受體,在電壓鉗模式下,將記錄神經(jīng)元鉗制在-60 mV分離出sEPSCs和sIPSCs,100 nM orexin-A明顯增加sEPSCs頻率(對(duì)照的202±56％;n=29

10、;P＜0.001;K-S檢驗(yàn))和幅度(對(duì)照的138±29％;n=29;P＜0.001;K-S檢驗(yàn)),也能增加sIPSCs的頻率(對(duì)照的199±45％;n=22;P＜0.001;K-S檢驗(yàn))和幅度(對(duì)照的114±11％;n=22;P＜0.001;K-S檢驗(yàn))。上述結(jié)果說明,orexin-A可同時(shí)增強(qiáng)EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞。
　　 在上述實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上,在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻斷電壓門控Na+通道,將記錄神經(jīng)

11、元鉗制在-60 mV分離出mEPSCs和mIPSCs,100 nM orexin-A明顯增加mEPSCs頻率(p＜0.001,n=6,K-S檢驗(yàn))和幅度(p＜0.001,n=6,K-S檢驗(yàn)),也能增加mIPSCs的頻率(p＜0.001,n=5,K-S檢驗(yàn))和幅度(p＜0.001,n=5,K-S檢驗(yàn))。上述結(jié)果表明:orexin-A既通過突觸前效應(yīng)又通過突觸后效應(yīng)影響突觸傳遞。
　　 灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻

12、斷OXR1s,100 nM orexin-A增加mEPSCs和mIPSCs的頻率(mEPSCs:P=0.17,n=6,K-S檢驗(yàn);mIPSCs:P=0.14,n=5,K-S檢驗(yàn))和幅度(mEPSCs-P=0.22,n=6,K-S檢驗(yàn);mIPSCs:P=0.10,n=5,K-S檢驗(yàn))的效應(yīng)消失,結(jié)果提示OX1Rs介導(dǎo)orexin-A增強(qiáng)突觸傳遞的效應(yīng)。
　　 4.Orexin-A誘發(fā)突觸后NMDA受體上調(diào)
　　 本實(shí)驗(yàn)采用

13、無Mg2+ACSF,在電壓鉗模式下,將記錄細(xì)胞鉗制在,60 mV。選用NMDA受體選擇性激動(dòng)劑NMDA(100μM)作用于EC淺層主要神經(jīng)元可誘發(fā)出內(nèi)向電流,電流幅值平均為824.9±163.7 pA(n=7)。此電流可完全被不可逆NMDA受體特異性拮抗劑MK-801(10μM)所阻斷。然后通過灌流方式給與100 nM orexin-A15～30min,在這期間浴槽中的MK-801被置換掉,再次應(yīng)用100μM NMDA后又可誘發(fā)出NMD

14、A受體介導(dǎo)的內(nèi)向電流(41.5±26.3 pA,n=7)。上述結(jié)果提示:orexin-A能夠使胞漿內(nèi)的NMDA受體轉(zhuǎn)移到胞膜上。
　　 5.腺苷激活腺苷A1受體降低EC淺層主要神經(jīng)元興奮性
　　 在電壓鉗模式下,通過將神經(jīng)元鉗制在-40 mV水平來誘發(fā)其放電,給與100μM腺苷后放電頻率逐漸減慢直至放電停止,沖洗后可恢復(fù)(n=31)。另外,在靜息電位水平下,腺苷使固定電流強(qiáng)度刺激下動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)目顯著減少(加藥前:5.5

15、±1.4個(gè);腺苷:2.4±1.3個(gè);沖洗后:5.2±1.3個(gè);n=16;P＜0.001)。接下來,在電流鉗模式下,腺苷能夠誘發(fā)神經(jīng)元膜電位超極化,并且超極化幅度具有劑量依賴性的特點(diǎn),50、100和200μM腺苷引起的平均超極化幅度分別為1.5±0.3(n=6)、2.8±0.5(n=20)、4.4±0.6 mV(n=12)。腺苷A1受體拮抗劑DPCPX(3μM)能夠阻斷腺苷的抑制效應(yīng),腺苷A2受體拮抗劑DMPX(10μM)卻不能。另外,H

16、CN通道激活劑8-Br-cAMP減弱腺苷的超極化效應(yīng),HCN通道阻斷劑ZD-7288阻斷腺苷的超極化效應(yīng)。上述結(jié)果表明:腺苷激活腺苷A1受體通過關(guān)閉HCN通道降低EC淺層主要神經(jīng)元興奮性。
　　 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:第一,orexin-A作用于突觸后OX1Rs激活PKC信號(hào)通路通過抑制持續(xù)K+通道同時(shí)激活NSCC提高EC淺層主要神經(jīng)元興奮性;第二,orexin-A通過激活OX1Rs增強(qiáng)EC淺層興奮性和抑制性突觸傳遞;第