基于CLNPROT技術(shù)對結(jié)直腸癌血清學分子標志kininogen-1的鑒定.pdf

1、研究背景與目的:
　　 結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年增高。提高結(jié)直腸癌的早期診斷率，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，是提高生存率、改善預后的關(guān)鍵。當前，國內(nèi)最常用的結(jié)直腸癌篩查診斷方法有2種:1.糞便隱血試驗(FecalOccultBloodTest，F(xiàn)OBT)，具有簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟，耐受性好等優(yōu)勢，但存在假陽性率及假陰性率較高等不足，雖可降低癌癥死亡率，但對癌癥發(fā)病率的影響小，這可能由于FOBT檢測腺瘤敏感度

2、低所致;2.全結(jié)腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡檢查，是目前“金標準”檢查方法，敏感性及特異性高，但需要專業(yè)的內(nèi)鏡醫(yī)生、風險較大、費用高、患者接受性差。目前常用的這些方法常難以滿足便捷、經(jīng)濟、安全、高效的大規(guī)模篩查需要，因此尋找新的更有效的結(jié)直腸癌早期診斷方法勢在必行。研究者們一直致力于尋找一些能夠串聯(lián)或并聯(lián)甚至替代現(xiàn)有的診斷的方法的新的檢測手段。尋找結(jié)直腸癌早診的分子標志譜/物是便是其中重要的方向之一，但這方面一直缺乏更廣更深的基礎(chǔ)與臨床研究。

3、>　　 蛋白質(zhì)組學的出現(xiàn)為尋找腫瘤標記物提供了一個新方向，從各種組織和體液中找出蛋白性分子標志物的方法主要都是基于二維聚丙烯酰胺凝膠電泳法(bi-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis，2D-PAGE)和表面增強激光解吸電離質(zhì)譜測定法(surfaceenhancedlaserdesorptionionizationmassspectrometry,SELDI-MS)。它們被用來探究用于癌

4、癥檢測的血清分子標志物。2D-PAGE能夠使樣本蛋白質(zhì)組中的大部分蛋白通過顯影方法被實時檢測出來，然而，由于復雜的步驟要求、長時間的耗時以及高昂的價格，該技術(shù)并不適合于臨床應(yīng)用。同樣地，由于存在穩(wěn)定性和可重復性欠佳的問題，SELDI-TOF-MS不可能適于常規(guī)的臨床應(yīng)用，而且也不太可能利用這一技術(shù)去鑒定那些已被挑選出來的潛在的生物標記物。德國布魯克公司于2004年成功的開發(fā)了一套CLINPROTTM系統(tǒng)，即磁珠(液體蛋白芯片)-MS/M

5、S技術(shù)，又稱為液體芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)。該系統(tǒng)是以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)為基礎(chǔ)，它可分為四個部分:磁珠分離系統(tǒng)、質(zhì)譜系統(tǒng)、分析軟件和可選的體液樣品自動處理系統(tǒng)。CLINPROT技術(shù)利用了磁珠親和純化原理，具有高通量、特異性好、重復性高的特點，不僅可以發(fā)現(xiàn)差異表

6、達的蛋白質(zhì)峰，而且可以對差異表達蛋白質(zhì)進行鑒定，捕獲蛋白種類多，可適用于不同的疾病和蛋白。目前，CLINPROT技術(shù)已在越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用。它在美國和德國已廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、頭頸鱗癌、前列腺癌等的早期診斷過程中，在我國也有這方面的研究，但還僅僅處于實驗室階段。
　　 在結(jié)直腸癌的研究方面，目前國內(nèi)外僅有2篇CLINPROT相關(guān)文獻報道。1篇重在評價磁珠分離技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)本身在血清學檢測中的應(yīng)用，并

7、沒有提到有臨床意義的篩查指標[44]。另1篇著重探討利用統(tǒng)計學上的線性判別分析技術(shù)結(jié)合交叉驗證法嚴格實驗條件后評價CLINPROT技術(shù)在結(jié)直腸癌患者血清學診斷中的作用，預測的敏感性為95.2％，特異性為90.0％，但該多肽譜并沒有得到大規(guī)模的臨床評價，研究缺乏早期病變樣本[45]。
　　 本研究以臨床病例為基礎(chǔ)，采用CLINPROTTM血清蛋白質(zhì)組學篩查技術(shù)，篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)的分子標志譜/物，評價其臨床應(yīng)用價值，并進行大樣本、

8、多層次臨床驗證，從而為進一步開展前瞻性研究、相關(guān)基礎(chǔ)機制研究及臨床檢測試劑盒的研發(fā)提供依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。最終促進結(jié)直腸癌預防和診療工作的開展，研究結(jié)果不僅可以有效提高結(jié)直腸癌早診早治率，對結(jié)直腸癌的診療監(jiān)測、個體化治療也具有重要的推動作用。
　　 材料和方法:
　　 1.利用CLINPROTTM技術(shù)對35例正常人、35例結(jié)直腸高危腺瘤患者、40例結(jié)直腸癌患者的血清樣品進行差異表達譜分析，建立疾病組和正常組的血清質(zhì)譜模型;<

9、br>　　 2.對各組間的差異多肽的二級鑒定，找出可作為結(jié)直腸癌早期診斷分子標志的血清蛋白;
　　 3.運用酶聯(lián)免疫吸附測定法對臨床上85例正常人，80例結(jié)直腸高危腺瘤患者，143例結(jié)直腸癌術(shù)前患者，58例結(jié)直腸癌術(shù)后患者，50例潰瘍性結(jié)腸炎患者，30例胃癌患者和40例肝細胞癌患者的血清進行驗證，觀察前期鑒定出的蛋白kininogen-1在各組血清中的差異表達情況。同時觀察85例正常人，80例結(jié)直腸高危腺瘤患者，143例結(jié)直腸

10、癌術(shù)前患者血清中CEA的表達情況，以便與kininogen-1進行對比分析;
　　 4.對75例正常腸道粘膜，77例結(jié)直腸高危腺瘤和248例結(jié)直腸癌石蠟標本進行kininogen-1分子的免疫組織化學染色，觀察該分子在腫瘤組織與正常組織之間的表達差別，進一步分析kininogen-1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用。
　　 5.統(tǒng)計方法:質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Bruker公司ClinProTools2.2進行圖譜繪制、校正和模型建立

11、，以QC算法進行統(tǒng)計分析。ELISA實驗和免疫組化實驗的所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，TTest測定各組之間患者年齡、病變大小的差異;Chi-squaretest檢測各組之間性別、組織學類型、上皮內(nèi)瘤變級別及kininogen-1的染色情況等的比較;Spearmanrank-ordercorrelationcoefficient測定每組間kininogen-1表達差異的相關(guān)性;One-WayANOVA及LSD方法分析EL

12、SA數(shù)據(jù);ROC曲線分析kininogen-1和CEA對于CRC的診斷效果;Kaplan-Meier(Log-ranktest)用于生存分析。所有分析結(jié)果取雙側(cè)P值，P＜0.05認為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.CLINPROT實驗結(jié)果
　　 (1).經(jīng)過CLINPROT質(zhì)譜軟件分析，發(fā)現(xiàn)正常組與高危腺瘤組之間存在信噪比＞10的差異蛋白峰70個，其中43個蛋白峰差異明顯(P＜0.001);正常組與CR

13、C組之間存在信噪比＞10差異蛋白峰61個，其中54個蛋白峰差異明顯(P＜0.001);高危腺瘤組與CRC組之間存在信噪比＞10差異蛋白峰83個，其中66個蛋白峰差異明顯(P＜0.001)。
　　 (2).成功建立了各組間最優(yōu)模型圖:正常組與高危腺瘤組之間最優(yōu)模型圖交叉驗證(crossvalidation，CV)為100％，識別能力(recognitioncapability,RC)為100％;正常組與CRC組之間最優(yōu)模型圖CV為

14、95.94％，RC為98.96％;高危腺瘤組與CRC組之間最優(yōu)模型圖CV為98.19％，RC為100％。
　　 (3).差異多肽的鑒定結(jié)果:在CRC組與正常組之間54個差異明顯的多肽中，根據(jù)多肽鑒定的條件，我們選定了質(zhì)荷比為1943及2081的兩個多肽進行鑒定。通過Mascot數(shù)據(jù)庫搜尋，這2個多肽均來自于同一個蛋白-kininogen-1。
　　 2.ELISA實驗結(jié)果
　　 (1).各組kininogen-1

15、的血清學濃度:
　　 各組患者之間性別無顯著性差異(F=11.390，P=0.077)，年齡存在顯著性差異(F=8.759，P=0.000)。CRC組血清中，Dukes'A期14例，Dukes'B期63例，Dukes'C期37例，Dukes'D期29例。經(jīng)one-wayANOVA統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，整體而言，kininogen-1濃度在各組間存在顯著性差異(F=8.680，P=0.000)。健康志愿者的血清kininogen-1平均濃度為

16、153.22±8.43μg/ml，CRC患者術(shù)前的血清kininogen-1平均濃度為215.62±7.63μg/ml，兩者之間存在顯著性差異(P＜0.001)。高危腺瘤組的kininogen-1平均濃度明顯高于健康志愿者組(194.26±10.14μg/mlvs153.22±8.43μg/ml，P=0.003)。CRC術(shù)前組與高危腺瘤組之間kininogen-1濃度無顯著性差異(P=0.082)。一旦接受了手術(shù)，CRC患者的血清kin

17、inogen-1濃度明顯下降(術(shù)前vs術(shù)后:215.62±7.63μg/mlvs188.04±11.70μg/ml，P=0.044).另一方面，GC組的kininogen-1平均濃度與健康志愿者組無顯著性差異(171.25±17.17μg/mlvs194.26±10.14μg/ml，P=0.334)。UC組和LC組的血清kininogen-1濃度也明顯高于健康志愿者組(P=0.000)。CRC術(shù)前患者的血清kininogen-1平均濃度

18、與UC組、LC組無顯著性差異。
　　 (2).kininogen-1對于結(jié)直腸腫瘤的診斷價值:
　　 診斷CRC時，kininogen-1的ROC曲線下面積為0.706;當合并CRC與高危腺瘤考慮(此時將CRC與高危腺瘤統(tǒng)稱為結(jié)直腸腫瘤)，我們發(fā)現(xiàn)kininogen-1的ROC曲線下面積為0.681;當合并CRC、高危腺瘤、UC共同考慮(此時將這三種疾病統(tǒng)稱為大腸疾病)，我們發(fā)現(xiàn)kininogen-1的ROC曲線下面積為

19、0.701。
　　 根據(jù)ROC曲線，血清kininogen-1濃度173.96μg/ml被認為是區(qū)分CRC患者和健康志愿者的截斷值，用此截斷值診斷CRC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是63.6％，65.9％，75.8％，51.9％，and64.5％。同樣，根據(jù)ROC曲線，血清kininogen-1濃度161.69μg/ml被認為是區(qū)分結(jié)直腸腫瘤患者和健康志愿者的截斷值，用此截斷值診斷結(jié)直腸腫瘤(包括結(jié)直腸高

20、危腺瘤和CRC)的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是62.3％，63.5％，81.8％，39.1％，and62.7％。血清kininogen-1濃度173.56μg/ml被認為是區(qū)分大腸疾病(包括CRC、高危腺瘤、UC)患者和健康志愿者的截斷值，用此截斷值診斷CRC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是61.2％，65.9％，85.2％,34.6％,and62.3％。
　　 (3).CEA在健康

21、志愿者組、高危腺瘤組及CRC組中的血清學濃度:
　　 在健康志愿者組、高危腺瘤組和CRC組，血清CEA的平均濃度分別是2.43±0.28，3.10±1.15和14.67±2.25μg/L(P＜0.001)。診斷CRC時，CEA的ROC曲線下面積為0.695。以5μg/L作為CEA截斷值診斷CRC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是38.5％，85.9％，82.1％，45.3％，and56.1％。較之單一分子表達

22、增高，若kininogen-1和CEA中的任一分子高于相應(yīng)截斷值時，診斷CRC的敏感度、陰性預測值和精確度都得到了提高。
　　 進一步，我們發(fā)現(xiàn)kininogen-1診斷Dukes'A期和B期CRC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是70.1％，65.9％，65.1％，70.9％，and67.9％;而CEA診斷Dukes'A期和B期CRC的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和精確度分別是39.0％，85.9

23、％，71.4％，60.8％，and63.6％。可以看出，除了特異度外，kininogen-1的其他參數(shù)值都明顯高于CEA的各個參數(shù)值。
　　 3.免疫組織化學染色實驗結(jié)果
　　 (1).在正常腸黏膜、高危腺瘤、CRC組織中kininogen-1的表達水平:
　　 我們共分析了75例正常結(jié)直腸黏膜、77例高危腺瘤和248例CRC患者的石蠟組織，三組之間患者性別、年齡無顯著性差異(P＞0.05)。kininogen-

24、1在正常結(jié)直腸黏膜中未發(fā)現(xiàn)陽性表達，而在高危腺瘤和CRC組織中的陽性表達體現(xiàn)為細胞漿積聚。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，高危腺瘤組織和CRC組織中kininogen-1的表達明顯強于其在正常結(jié)直腸黏膜中的表達(48.39％vs15.58％vs0.00％，P＜0.05)。
　　 (2).kininogen-1胞漿表達水平與臨床特點的相關(guān)性
　　 通過Spearman相關(guān)分析我們發(fā)現(xiàn)，高危腺瘤中kininogen-1的表達水平與腺瘤的組織

25、學類型具有負相關(guān)性(rs=-0.250，P=0.029)，即管狀腺瘤組織中更易出現(xiàn)kininogen-1的表達。kininogen-1與腺瘤的部位、大小及上皮內(nèi)瘤變程度無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 在CRC中，kininogen-1的胞漿表達與Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有正相關(guān)性(Duke's分期:rs=0.151，P=0.018;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:rs=0.128，P=0.045)，即發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke's

26、分期越高的病例中越容易出現(xiàn)kininogen-1的陽性表達。而與腫瘤發(fā)生部位、大小、分化程度及遠處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 (3).生存分析
　　 我們根據(jù)kininogen-1表達水平和患者的隨訪情況進行了生存曲線分析，共有110例CRC患者進行了完整的隨訪資料收集。雖然統(tǒng)計學上差異不顯著(P=0.166)，但是kininogen-1免疫組織化學染色顯示陰性表達的CRC患者，較之kininogen-1陽