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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)建立早期診斷結(jié)直腸癌的模型
目的:
應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)建立和驗(yàn)證結(jié)直腸癌早期診斷模型并篩選出可早期診斷的蛋白標(biāo)志物。
方法:
隨機(jī)選取46例結(jié)直腸癌患者和35例健康人的血清,用銅離子螯合磁珠提取血清多肽后用MALDI-TOF MS檢測(cè)肽質(zhì)量指紋圖譜,并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件根
2、據(jù)不同的運(yùn)算法則建立不同模型,并用另外45個(gè)腸癌血清標(biāo)本和42個(gè)健康對(duì)照人群血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),從中選出有最佳診斷性能的模型。同時(shí),另選取46個(gè)其他腫瘤患者的血清標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證。為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的性能,另選取其他269位腸癌患者的血清和110位健康對(duì)照人群的血清對(duì)所建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)模型中的蛋白峰進(jìn)一步通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。
結(jié)果:
基于建模組和測(cè)試組的血清質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)基于Fisher算法的擁有5個(gè)差異蛋白
3、峰(m/z1778.97、1866.16、1934.65、2022.46和4588.53)的診斷模型具有最佳的判別性能。訓(xùn)練集的敏感度和特異度均為100%,測(cè)試集的敏感度和特異度分別為95.6%和83.3%。且該模型在診斷其他非腸癌腫瘤時(shí),僅有54.3%(25/46)的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步進(jìn)行外源性驗(yàn)證時(shí),該模型可獲得94.4%(254/269)的敏感度,75.5%(83/110)的特異度和88.9%(337/379)的準(zhǔn)確性。隨后,我們進(jìn)一
4、步用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)上述蛋白峰進(jìn)行鑒定,結(jié)果判定前面4個(gè)都是補(bǔ)體C3f的片段。
結(jié)論:
基于Fisher算法的擁有上述5個(gè)蛋白峰的診斷模型,能有效區(qū)分腸癌患者與健康對(duì)照組和其他腫瘤,而且該模型可能具有腸癌特異性。在該模型中,在腸癌患者中濃度明顯下降的血清補(bǔ)體C3f,可能與腸癌的發(fā)生相關(guān)。
第二部分應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)建立預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的模型
目的:
本研究擬
5、應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)從結(jié)直腸癌伴或不伴肝轉(zhuǎn)移患者血清中篩選蛋白標(biāo)志物,建立相應(yīng)的模型,從而有助于預(yù)測(cè)肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
方法:
選取在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院結(jié)直腸癌專業(yè)組的手術(shù)病例,根據(jù)隨訪的結(jié)果將結(jié)直腸癌患者分為3類:無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者(根治術(shù)后至少3年以上無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移)、同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者(診斷腸癌時(shí)或根治術(shù)后6個(gè)月內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移)和異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者(根治術(shù)后6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移)。本研究選取其中兩類:64例異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移患者和64例無(wú)復(fù)發(fā)
6、轉(zhuǎn)移患者,隨機(jī)抽取兩組各40個(gè)血清樣品,建立決策樹模型,并用剩余的血清樣品用來(lái)測(cè)試該模型的性能。并進(jìn)一步將此模型中的蛋白峰通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。
結(jié)果:
異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移和無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移兩組患者在性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度上無(wú)顯著差別。術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)水平不能用于預(yù)測(cè)根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移。本研究獲得8個(gè)蛋白峰(m/z3315、6637、1207、1466、4167、4210、2660和4186)所建立
7、的決策樹模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分訓(xùn)練集中82.5%(33/40)的無(wú)轉(zhuǎn)移和80%(32/40)的異時(shí)性轉(zhuǎn)移,測(cè)試集中79.2%(19/24)的無(wú)轉(zhuǎn)移和70.8%(17/24)的異時(shí)性轉(zhuǎn)移。決策樹模型中使用的蛋白峰通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜被鑒定為甲胎蛋白的片段、補(bǔ)體C4A的片段、纖維蛋白原α的片段、真核肽鏈釋放因子GTP結(jié)合亞基ERF3B的片段和血管緊張素原的片段等。
結(jié)論:
在本研究?jī)?nèi)性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度相匹配
8、的患者中,包括8個(gè)蛋白峰所建立的決策樹模型則可以很好地預(yù)測(cè)根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
第三部分結(jié)直腸癌組織差異表達(dá)蛋白的鑒定和分析
目的:
腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,如果在早期發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)患者可通過(guò)手術(shù)治療治愈,但實(shí)際上大多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期,預(yù)后較差。因此,早期診斷腸癌是很迫切的需要。本研究通過(guò)組織蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定用于早期診斷腸癌的生物標(biāo)志物。
方法:
收集5位病理證實(shí)為結(jié)直腸癌患者
9、的腸癌、癌旁和正常粘膜組織,應(yīng)用雙向電泳技術(shù)得到雙向電泳凝膠圖譜,經(jīng)圖像分析尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。后將蛋白點(diǎn)切下經(jīng)酶切,進(jìn)行質(zhì)譜分析,再查庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。然后,進(jìn)一步用差異蛋白進(jìn)行GO分析和pathway分析等生物信息學(xué)分析。此外,還應(yīng)用Western Blot方法從蛋白水平驗(yàn)證候選的蛋白標(biāo)志物。
結(jié)果:
總計(jì)有50個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在正常組與癌旁/癌組表達(dá)差異,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定,得到31個(gè)可能與腸癌發(fā)生相關(guān)的差異蛋白。
10、Gene Ontology(GO)分析顯示,按細(xì)胞組分分類,細(xì)胞質(zhì)和線粒體的差異蛋白所占比例較大;按分子功能分類,涉及細(xì)胞結(jié)合、氧化還原酶活性、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶活性的比例較大;按生物學(xué)過(guò)程分類,氧化還原、抗凋亡、糖皮質(zhì)激素刺激反應(yīng)、脂肪代謝等所占比例較大。Western Blot檢測(cè)顯示I-FABP在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著下調(diào),HSP27在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。
結(jié)論:
1.運(yùn)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析和生物信
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