煙草本塞姆氏（Nicotiana Benthamiana）中DREB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析.pdf

1、干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫是影響植物生長發(fā)育和品質(zhì)形成的主要環(huán)境因素。在煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于煙苗移栽期的低溫和苗期及煙株生長發(fā)育后期的干旱，對煙株生長發(fā)育和煙葉品質(zhì)形成造成了不良影響，給煙農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失。長期以來為解決這一問題，煙草科技工作者從栽培和大田管理方面采取了許多措施，但收效甚微，只有從分子水平徹底改造煙株對非生物脅迫的適應性和耐受性，才能徹底解決這一問題。DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控煙草基因組中一系列抗非生物逆境脅迫的功能基

2、因表達，增強煙株在逆境脅迫中的耐受性，因此對煙草中DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的分離克隆及功能分析，將為采用分子生物學方法提高煙株的抗逆性奠定基礎。本研究以野生煙草本塞姆氏(NicotianaBenthamiana)品種為實驗材料，從中分離克隆得到兩個DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其功能進行分析，發(fā)現(xiàn)了煙草中DREBP與DRE順式元件結合的關鍵氨基酸。主要研究內(nèi)容如下： 1.通過從GenBank獲取得到的EST序列分析，利用分子生物學技術

3、從煙草中克隆得到具有AP2/EREBP結構域特征的NbDREB1和NbDREB2兩個基因。將NbDREB1和NbDREB2基因插入YepGAP酵母單雜交載體進行功能檢測，發(fā)現(xiàn)兩個基因的WDRE型酵母轉(zhuǎn)化體均不能在含有0.03mol/L3-AT的SD/His-Ura-Trp-平板上生長；進一步將NbDREB1和NbDREB2基因插入到酵母單雜交載體pGADT7中做反式激活檢測，結果顯示只有NbDREB1/pGADT7重組體能在含有0.03

4、mol/L3-AT的SD/His-Ura-Trp-平板上生長，并激活β-galactosidase報告基因表達。表明NbDREB1能特異結合DRE順式作用元件，但不具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能。 2.分析NbDREB1和NbDREB2基因的AP2區(qū)，發(fā)現(xiàn)NbDREB1的49位K和NbDREB2的49位R同為堿性氨基酸，性質(zhì)相近；而NbDREB1第2位Y和NbDREB2第2位N一個為芳香族氨基酸、一個為中性氨基酸，性質(zhì)上差別較大。因此，選定在

5、NbDREB1和NbDREB2基因的AP2區(qū)第二位氨基酸處進行點突變。突變后的AP2區(qū)插入酵母單雜交載體pGADT7進行功能檢測，NbDREB2第二位氨基酸N突變成Y后能在含有0.03mol/L3-AT的SD/His-Ura-Trp-平板上生長，并激活β-galactosidase報告基因表達；而NbDREB1的第二位氨基酸Y突變成N后失去了與DRE元件結合的能力。表明煙草DREB類轉(zhuǎn)錄因子AP2區(qū)的第2位酪氨酸殘基(Y)是識別并結合D