STAT1和H2AX基因shRNA慢病毒載體構(gòu)建及食管癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染.pdf

1、目的:通過構(gòu)建食管癌細(xì)胞株TE-13和ECA109中的人基因STAT1和H2AX低表達(dá)的人食管癌細(xì)胞株,觀察人食管癌細(xì)胞TE-13、ECA109中STAT1和H2AX在mRNA水平、射線作用前后蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)表達(dá)的變化,為進(jìn)一步探討抑制STAT1和H2AX基因蛋白表達(dá)對(duì)食管癌TE-13、ECA109細(xì)胞放射敏感性的影響提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:根據(jù)STAT1和H2AX的mRNA序列,STAT1選擇了4個(gè)19nts的靶

2、序列,H2AX分別選擇了2個(gè)19nts和2個(gè)21nts的靶序列設(shè)計(jì)并合成包含正、反義序列的互補(bǔ)單鏈DNA,同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)無義對(duì)照序列。退火后插入pGCSIL載體的H1RNA啟動(dòng)子后產(chǎn)生pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL-STAT1-shRNA3、pGCSIL-STAT1-sh-RNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA2、pGCSIL-H2A

3、X-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4和pGCSIL-negative;以上質(zhì)粒均需要經(jīng)過PCR和測(cè)序鑒定。鑒定正確后,轉(zhuǎn)染TE13和ECA109細(xì)胞,采用western blotting的方法檢測(cè)STAT1和H2AX的蛋白表達(dá),比較四種質(zhì)粒RNA的干擾效果,篩選出RNA干擾效果最佳的質(zhì)粒,將干擾效果最佳的質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒混合物共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后,收集上清并過濾即為病毒液,該病毒液轉(zhuǎn)染TE13和ECA109

4、細(xì)胞72h后,采用Real-Time PCR和western blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞中基因STAT1和H2AXmRNA水平及蛋白質(zhì)水平的變化,并采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)STAT1和H2AX斑點(diǎn)形成的變化。
　　 結(jié)果:①成功地將STAT1和H2AX shRNA與pGCSIL-GFP質(zhì)粒連接并經(jīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后,再提取質(zhì)粒DNA;②STAT1和H2AX shRNA轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞珠TE13和ECA109后,其

5、目的蛋白表達(dá)水平均下降明顯,pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-STAT1-shRNA2、pGCSIL-STAT1-sh-RNA3、pGCSIL-STAT1-shRNA4和pGCSIL-H2AX-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA2、pGCSIL-H2AX-shRNA3、pGCSIL-H2AX-shRNA4在TE13細(xì)胞系較空白對(duì)照組分別下降了75％、60％、26％、22％和81％、56％、21％、33％

6、;在ECA109細(xì)胞系較空白對(duì)照組分別下降了34％、22％、72％、61％和29％、34％、74％、62％;③pGCSIL-STAT1-shRNA1、pGCSIL-H2AX-shRNA3和慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后,再收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,對(duì)其濃縮后得到的高滴度慢病毒濃縮液收集上清并過濾為病毒液,該病毒液感染TE13和ECA109細(xì)胞72h后,在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色

7、熒光,熒光率達(dá)80％以上,即為人基因STAT1和H2AX蛋白低表達(dá)的食管癌細(xì)胞株;④對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株采用Real-Time PCR和westernblotting方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因STAT1蛋白低表達(dá)的食管癌TE13轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了73％和69％,基因STAT1蛋白低表達(dá)的食管癌ECA109轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了66％和65％;基因H2AX蛋白低表達(dá)的食管癌TE13轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在mRNA和

8、蛋白水平上分別下降了66％和83％,基因H2AX蛋白低表達(dá)的食管癌ECA109轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在mRNA和蛋白水平上分別下降了68％和63％;⑤用轉(zhuǎn)染的食管癌細(xì)胞株應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4Gy放射線照射和順鉑處理后細(xì)胞核內(nèi)STAT1和H2AX斑點(diǎn)的形成明顯減少。
　　 結(jié)論:采用質(zhì)粒連接的STAT1和H2AX shRNA轉(zhuǎn)染TE13和ECA109細(xì)胞后,其目的蛋白的表達(dá)均被明顯抑制,成功構(gòu)建了STAT1和H