TENS及COFFEE OR CAFFEINE對DCP干預機制的基礎實驗研究.pdf

1、糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，糖尿病性神經(jīng)病變是糖尿病慢性并發(fā)癥中發(fā)病率最高的一種，糖尿病膀胱?。╠iabetic cystopathy， DCP）是糖尿病外周神經(jīng)病變的一種，屬于神經(jīng)源性膀胱尿道功能障礙（Neuropathic dysfunction of bladder，NB）。作為糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，其發(fā)病率占糖尿病患者的50％左右。臨床研究顯示即使對于那些血糖控制穩(wěn)定的患者，仍有25％的DCP發(fā)病率。 尋找有

2、效的方法，盡早積極預防和治療糖尿病膀胱病變，改善下尿路癥狀，是糖尿病患者綜合治療及提高生活質(zhì)量的重要組成部分。目前糖尿病神經(jīng)病變的治療主要集中在藥物治療，藥物治療雖有一定效果，但副作用不可忽視。另外，有創(chuàng)治療包括間歇清潔導尿、膀胱造瘺術、尿道膀胱頸切開等方法，可緩解大量剩余尿的問題，改善剩余尿造成的尿路感染和上尿路損傷，但治標不治本，且處理不當易招致進一步的感染。如何找到有效、安全的預防、治療DCP病變，解除DCP逼尿肌無力、剩余尿多，

3、一直是人們在探索的問題。早期積極預防DCP的發(fā)生和發(fā)展，是糖尿病患者綜合治療及提高生活質(zhì)量的關鍵所在。 使用體外電脈沖刺激（Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation，TENS）技術治療DCP報道甚少，且尚無其尿動力學及機制方面的研究。另研究發(fā)現(xiàn)常飲咖啡可降低2型糖尿病的發(fā)病率，咖啡因?qū)μ悄虿“螂撞〉淖饔萌绾危坑写^察。 本研究通過制備糖尿病膀胱的大鼠模型，采用體外脈沖電刺激（

4、TENS）的方法，及采用coffee or caffeine對DCP大鼠給予咖啡因水溶液（10mg·kg-1·d-1）及雀巢咖啡水溶液經(jīng)口灌胃干預治療，觀察對糖尿病膀胱大鼠的排尿功能的影響，進一步通過尿動力學，細胞生物學，生物化學及分子生物學研究，從神經(jīng)源性和肌源性兩方面探討TENS及coffee or caffeine對于糖尿病膀胱的作用機制及療效。對今后臨床應用TENS技術（經(jīng)體表）治療糖尿病膀胱病病變的患者及通過每日飲用適量咖啡來

5、阻止糖尿病膀胱病病變的進一步發(fā)展，減少膀胱剩余尿（BRU），提供幫助。這將是簡便而經(jīng)濟的方法，可取得較好的經(jīng)濟效益和社會效益。 第一部分、DCP動物模型的建立和尿動力學及病理組織學觀察。 目的：掌握建立DCP大鼠模型的方法，為下一步干預性研究打下基礎。觀察DCP的尿動力學及病理學改變，初步探討發(fā)病機制及病理演繹過程，為診治提供依據(jù)。 方法：66只SD雄性大鼠隨機分為2組，即正常對照組（NC組）30只，糖尿病組（D

6、M組）36只、對36只8周齡的SD雄性大鼠腹腔注射STZ （60 mg/Kg）的檸檬酸緩沖液48小時后，鏈脲佐菌素腹腔注射誘導糖尿病大鼠模型，以連續(xù)3次測空腹血糖>12mmol·L-1為糖尿病模型建立成功。飼養(yǎng)60天后，進行膀胱靜態(tài)壓、最大膀胱容量、最大膀胱收縮壓等尿動力學測定。然后行膀胱濕重、膀胱壁厚度及光鏡、電鏡的病理學等項觀察。 結果：DM組36只SD雄性大鼠48小時后，有33只大鼠空腹測尾靜脈血糖>12mmol·L-1，

7、糖尿病模型成功率達91.67％，至實驗60天糖尿病大鼠總共死亡9只，存活率達72.73％。60天后，DCP鼠膀胱靜態(tài)壓0.95±0.10 kpa，對照組為0.60±0.03 kpa（P<0.05）； DCP鼠最大膀胱容量3.49±0.40ml，而對照組為1.82±0.12ml （P<0.01）； DCP鼠最大膀胱收縮壓3.09±0.10 kpa，對照組為4.91±0.30 kpa （P<0.01）； DCP鼠膀胱順應性（ml/kpa）

8、1.39±0.11 ml/kpa，對照組為0.68±0.07 ml/kpa （P<0.01）；與對照組鼠相比，DCP鼠濕重，膀胱壁厚度均增加（P<0.05）； DCP鼠逼尿肌邊緣有空泡樣變性，肌細胞核核固縮、細胞連接纖維化，成纖維細胞變性及膠原纖維排列紊亂。 結論：DCP大鼠60天已有膀胱的動力學及病理學改變，提示盡管一些DM患者可無明顯的排尿障礙，但客觀的病理組織及尿動力學已有改變，建議對DCP患者應給予干預，控制病情的進一步

9、惡化。 第二部分、TENS與非TENS對DCP干預的對照基礎實驗研究。 目的：通過制作的糖尿病膀胱大鼠模型，探討體外電刺激的方法對糖尿病膀胱大鼠的排尿功能的影響及作用機理。 方法：將SD雄性大鼠隨機分為正常對照組（NC組）14只、糖尿病對照組（DM組）和糖尿病電刺激組（DM治療組），后二組各18只，運用腹腔內(nèi)注射STZ的方法制作糖尿病膀胱大鼠模型：造模成功后第10周起，DM治療組予體外電刺激治療，刺激參數(shù)強度31

10、 V，密度31 Hz（二對電極分別置于膀胱體表投影區(qū)和骶尾關節(jié)上方0.5厘米處），其它二組均不予電刺激，持續(xù)治療3周后（造模成功后第13周起）觀察比較各組間尿動力學指標改變（膀胱濕重，膀胱閾容量，排尿后剩余尿量，剩余尿比值，排尿時最大膀胱壓力），逼尿肌肌條收縮功能及膀胱組織光鏡及超微結構的變化，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）半定量測定背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的降鈣素基因相關肽（CGRP）的mRNA含量，運用Western-blot

11、方法檢測各組大鼠膀胱壁及DRG的CGRP蛋白的表達量的變化。 結果：DM治療組大鼠與DM組大鼠相比，其膀胱收縮力增強（DM組：19.49±6.51mmHg； DMT組：30.0±3.84 mmHg）剩余尿量比（R％）有所下降（DM組：42.83±8.71；DMT組：32.82±6.72），膀胱排尿閾容量減少（DM組：1.4±0.40ml； DMT組：0.93±0.26ml），各組間其差異均有統(tǒng)計學意義；組織病理學顯示DM組大鼠的

12、逼尿肌肌細胞代償性肥大，胞內(nèi)線粒體腫脹，細胞間質(zhì)與膠原纖維增生明顯；DM治療組大鼠的逼尿肌肌細胞肥大明顯減輕，胞內(nèi)線粒體無明顯腫脹，細胞間質(zhì)及膠原纖維增生不明顯。DM治療組大鼠膀胱壁及背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的CGRP蛋白表達含量較DM組明顯增加，DM治療組大鼠RT-PCR結果顯示其DRG的CGRP的mRNA含量也較DM組明顯增多。 結論：體外電刺激治療可以①促進糖尿病膀胱大鼠膀胱壁和DRG的CGRP蛋白的合成，并有效的運輸至膀胱壁

13、發(fā)揮作用，改善膀胱充盈感覺功能，恢復排尿功能的始動因素；②修復胞漿內(nèi)線粒體等細胞器的正常結構和功能，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的濃度，從而增強逼尿肌收縮力；③促進NGF因子，或神經(jīng)損傷/再生長相關基因的表達，幫助完成神經(jīng)的修復過程。 第三部分、coffee or caffeine對DCP作用的基礎實驗研究。 目的：通過建立的糖尿病大鼠動物模型，觀察糖尿病大鼠膀胱的形態(tài)、功能及組織病理學變化，探討咖啡與咖啡因?qū)μ悄虿〈笫蟀螂坠δ苷系K的

14、影響及可能的作用機制。 方法：75只SD雄性大鼠隨機分為4組，即正常對照組（NC組）15只，糖尿病組（DM組）、糖尿病咖啡治療組（Coffee組）及糖尿病咖啡因治療組（Caffeine組）每組各20只。鏈脲佐菌素腹腔注射誘導糖尿病大鼠模型，以連續(xù)3次測空腹血糖>12mmol·L-1為糖尿病模型建立成功。Caffeine組大鼠給予咖啡因水溶液（10mg·kg-1·d-1）經(jīng)口灌胃，Coffee組大鼠給予雀巢咖啡水溶液（286mg·

15、kg-1·d-1）經(jīng)口灌胃，其余兩組以等量蒸餾水每日經(jīng)口灌胃，連續(xù)7周。7周后通過尿動力學檢測、離體肌條的收縮實驗、放免測定及組織病理學檢查等技術，測定并比較各組大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量、相對排尿量（V％）、排尿后的剩余尿量、膀胱環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量、逼尿肌肌條的收縮力、背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的CGRP蛋白表達、膀胱組織光鏡及超微結構的變化。 結果：7周后相對于NC組大鼠，DM組大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量及排尿后的剩余

16、尿量明顯增加（P<0.01），而V％與膀胱cAMP含量顯著減少（P<0.01）。與DM組相比，Coffee組或Caffeine組糖尿病大鼠的膀胱濕重量、膀胱閾容量及排尿后的剩余尿量顯著減少（P<0.05），V％與膀胱cAMP含量明顯升高（P<0.05）。肌條收縮實驗顯示與NC組相比，DM組大鼠早期逼尿肌肌條的收縮力已明顯改變（P<0.05）；在Coffee組或Caffeine組，糖尿病大鼠逼尿肌肌條的收縮性明顯改善（P<0.05）。組織

17、病理學研究顯示DM組大鼠的逼尿肌肌細胞代償性肥大，胞內(nèi)肌漿網(wǎng)代償性增多，線粒體腫脹，細胞間質(zhì)與膠原纖維增生明顯；在Coffee組或Caffeine組，糖尿病大鼠的逼尿肌肌細胞肥大明顯減輕，胞內(nèi)肌漿網(wǎng)明顯減少，線粒體無腫脹，細胞間質(zhì)與膠原纖維增生不明顯。 結論：咖啡與咖啡因的治療能改善糖尿病大鼠膀胱病變，咖啡可能通過其中的咖啡因可以增加糖尿病膀胱大鼠膀胱壁和DRG的CGRP蛋白、CGRP的mRNA的表達、增加逼尿肌收縮力及膀胱的充