氨基葡萄糖硫酸鹽和小檗胺誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、白血病是一類臨床常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，現(xiàn)代常規(guī)治療方法的效果已達(dá)到一平臺期，大部分患者由于不能耐受化療藥物的毒副作用或者因白血病細(xì)胞對化療藥物的耐藥而導(dǎo)致治療失敗。目前誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡是治療白血病的策略之一，因此尋找高效低毒的自血病細(xì)胞誘導(dǎo)劑顯得尤為迫切。腫瘤凋亡機(jī)制的深入研究，將為治療惡性腫瘤奠定良好的基礎(chǔ)。 氨基葡萄糖硫酸鹽(glucosamine，GS)是氨基葡萄糖的一種重要衍生物，是人體內(nèi)合成氨基粘性多糖、糖蛋白、糖

2、脂等大分子的重要原料。最近實驗研究揭示了GS一種新的生物學(xué)作用，研究曾發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖及其鹽酸鹽可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨噬細(xì)胞方向分化，其硫酸鹽可誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。GS來源于自然生物，安全可靠，毒副作用??；具有比同類產(chǎn)品更高的生物利用度；具有很強(qiáng)的穿透力，能夠迅速進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部；但在血液系統(tǒng)腫瘤方面研究較少。有研究報道GS能夠激活CaspaSe-3和下調(diào)Bcl-2蛋白水平，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用主要是通過線粒體途徑，下調(diào)Bcl-2，改變

3、跨膜電位，促進(jìn)膜通透孔開放，激活Caspase-3而實現(xiàn)的。 小檗胺(Berbamine，BBM)是從我國中草藥小檗科(Berberis)植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，小檗胺及其衍生物均為鈣調(diào)素拮抗劑(Calmodulin antagonist)。近來有研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺不僅具有逆轉(zhuǎn)白血病耐藥的作用，而且也有明顯的抗腫瘤作用。BBM對慢性粒細(xì)胞白血病急變期K562細(xì)胞、Imatini耐藥的K562細(xì)胞及原代白血病細(xì)胞的生長

4、均具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，但其作用分子機(jī)制仍不十分清楚。有研究報道BBM誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的明顯的Caspase-3表達(dá)水平增高。由于這兩種藥物在誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中具有一定的交叉點，所以我們選擇這兩種藥物聯(lián)合使用，探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路是否有相加性，從而能否進(jìn)一步增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用。 Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的IAPs家族獨特成員，Survivin基因定位于17q25染色體，在正常

5、人的胎盤和胸腺組織中有微弱表達(dá)，在其他正常組織中幾乎都檢測不到。Survivin在近乎所有的常見惡性腫瘤組織及白血病中都有過量表達(dá)，其高表達(dá)常提示患者預(yù)后不良。Survivin能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，并在細(xì)胞的有絲分裂中起重要作用。Survivin可抑制凋亡通路下游的Caspase-3和Caspase-7的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3和Caspase-7，從而發(fā)揮抗凋亡作用。因此以該基因為靶點，可為基因治療白血病提供很好

6、的途徑。 Caspases(cystein aspartate-specific proteases)是一組具有高度同源性，并且與細(xì)胞因子成熟和細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。Caspases家族被發(fā)現(xiàn)至今其成員已超過14種，其中Caspase-3在很多正常細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，是Caspases瀑布式激活反應(yīng)中重要的效應(yīng)分子，可激活其他的Caspases，被稱為“放大器”蛋白酶。因此Caspase

7、-3是細(xì)胞凋亡過程中的激活的關(guān)鍵酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)分子，其活性的改變直接影響細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。在細(xì)胞凋亡執(zhí)行過程中，Caspase-3作為凋亡級聯(lián)途徑中的關(guān)鍵酶，可全部或者部分識別并水解相應(yīng)底物蛋白。一旦被凋亡信號途徑激活，Casoase-3能將細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。 細(xì)胞色素C(cytochrome，Cyt C)是一種水溶性蛋白，位于線粒體內(nèi)外膜之間，并與內(nèi)膜松弛相連。Cyt c除參與細(xì)胞有氧呼吸活

8、動外，在激活Caspases及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要意義。當(dāng)其從線粒體位移至細(xì)胞質(zhì)中并與凋亡活化因子-1(apoptotic protease-activating factor，Apaf-1．)結(jié)合后，再與procaspase-9相互作用，形成凋亡復(fù)合體，從而激活Caspase-3，啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究中我們選擇Survivin、Cyt c、Caspase-3這三種有緊密聯(lián)系的蛋白作目的本實驗旨在研究GS與BBM

9、聯(lián)合及單獨用藥誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制：首先分別檢測不同濃度GS、BBM單獨作用對K562細(xì)胞的增殖抑制率，得出二者單獨作用的最佳有效濃度；然后將此二最佳有效濃度聯(lián)合應(yīng)用，觀察其聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)；檢測兩種藥物單獨以及聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化以及胞漿中Cyt c蛋白含量的變化來探討其誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制，并觀察兩者是否有協(xié)

10、同促細(xì)胞凋亡效應(yīng)。 方法 細(xì)胞培養(yǎng)，以不同劑量的藥物處理慢性粒細(xì)胞白血病急變期K562細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并拍照；用細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)細(xì)胞生長情況并描繪細(xì)胞生長曲線；MTr比色法檢測細(xì)胞增殖抑制情況并計算增殖抑制率，找出兩種藥物單獨作用的最佳有效濃度；并將此二最佳有效濃度聯(lián)合應(yīng)用再次檢測細(xì)胞增殖抑制情況并計算增殖抑制率；取對數(shù)期生長期細(xì)胞，隨機(jī)分為四組：對照組(未用藥物處理的K562細(xì)胞)、實驗1組(5.0m

11、mol/L，GS處理的K562細(xì)胞)、實驗2組(10mg/LBBM處理的K562細(xì)胞)、實驗3組(5.0mmol/LGS和10mg/LBBM聯(lián)合處理的K562細(xì)胞)；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞早期凋亡率并檢測Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)水平的變化；Western blot檢測藥物作用前后線粒體是否有Cyt c蛋白釋放入胞漿的變化。 結(jié)果 MTT比色法結(jié)果顯示5.0mmil/L GS與10mg/L BBM

12、為抑制細(xì)胞增殖的最佳有效濃度，且實驗3組對K562細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡率顯示各實驗組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)，在72h時實驗3組細(xì)胞凋亡率明顯增高為 (71.09±1.24)％，聯(lián)合用藥呈現(xiàn)很強(qiáng)的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。實驗3組Caspase-3、Survivin蛋白的陽性表達(dá)率在72小時分別為(78.46±0.12)％、(8.24±0.45)％，前者明顯高于對照組(7.56±1.33)％(P<0.01)、而后者則明

13、顯低于對照組(38.24±0.14)％(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示72h實驗3組細(xì)胞胞漿中Cyt c蛋白含量顯著高于對照組和實驗1、2組(P<0.05)。結(jié)論1．GS、BBM單獨及聯(lián)合用藥均可抑制K562細(xì)胞的增殖，且聯(lián)合用藥后對K562細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。 2．檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥后K562細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于對照組及單獨用藥組，說明兩者聯(lián)合使用可以增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用，具有

14、協(xié)同效應(yīng)，且有一定的時間依賴性。 3．實驗過程中伴有胞漿Cyt c蛋白含量升高、Survivin蛋白表達(dá)的下調(diào)、Caspase-3蛋白表達(dá)的上調(diào)。 4．二者單獨用藥對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用主要是通過線粒體-Caspases途徑，并推測聯(lián)合用藥后對細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用的增強(qiáng)是因為此途徑的相加性。 5．Survivin蛋白的減少可以在一定程度上緩解對Caspase-3的抑制作用，進(jìn)一步增強(qiáng)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用。