氨基葡萄糖硫酸鹽誘導(dǎo)K562細胞凋亡中Cathepsin D與Bcl-XL作用研究.pdf

1、研究背景：
　　細胞是機體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，在機體代謝過程中相互協(xié)調(diào)，其中細胞凋亡（apoptosis）對于調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用。細胞凋亡是細胞死亡的一種形式，一種基本的生命現(xiàn)象，參與機體的生長發(fā)育及衰老等多種生理過程，同時也是參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制的重要因素。細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子調(diào)控機制一直是生命科學(xué)研究領(lǐng)域包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中的一個非常重要的基本問題。雖然目前凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途

2、徑已經(jīng)明確，溶酶體是介導(dǎo)細胞凋亡的重要結(jié)構(gòu)，且在不同誘導(dǎo)因素引發(fā)凋亡時，其凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑存在差異，但在多種誘因下溶酶體與線粒體之間凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機制尚未明確。
　　本實驗是在前期研究的基礎(chǔ)上進行的，既往我們發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖硫酸鹽（GlucosamineSulfate，GS）可以誘導(dǎo)K562細胞凋亡，并且這種凋亡是通過溶酶體途徑釋放CathepsinD(CatD)介導(dǎo)的，而且與Bcl-XL的下調(diào)相關(guān)結(jié)果
　　1．0.5m

3、mol.L-1、1.0mmol.L-1、5.0mmol.L-1的GS誘導(dǎo)均有細胞抑制作用，5.0mmol.L-1的GS抑制性最強。HE染色對照組K562細胞呈圓形，邊界光滑，胞膜無皺縮，而5.0mmol.L-1GS處理72h后，細胞皺縮，胞膜不光滑，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象并且細胞有出芽現(xiàn)象。5.0mmol.L-1GS處理72h后Hoechst33342染色顯示出凋亡細胞存在。5.0mmol.L-1GS處理72h后DNAladder的電泳圖片上出現(xiàn)

4、180-200bp明顯條帶；在流式細胞儀檢測中對照的K562細胞，也有少許凋亡，為腫瘤細胞的自發(fā)凋亡，而經(jīng)過5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后的K562細胞，凋亡明顯增多。與未處理的K562細胞相比5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后凋亡率由3.8％變成12.4％,P<0.05，。
　　2．經(jīng)過5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h后的K562細胞，CatD與Bcl-XL的激光共聚焦信號明顯增強，CathepsinD蛋白表達增

5、加，而Bcl-XL蛋白表達減少。K562細胞經(jīng)用PepstatinA處理，再用5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h較GS處理組的CatD的表達減弱，CatD與Bcl-XL的共定位信號較處理前的信號明顯增強，CatD蛋白表達減少，而Bcl-XL蛋白表達則沒表現(xiàn)出明顯差異。
　　3．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNA后免疫熒光雙標(biāo)的激光共聚焦顯示：分別轉(zhuǎn)染CatDsiRNA和Bcl-XLsiRNA組的K562細胞，被轉(zhuǎn)染抑制的信號在共定位的信號中明

6、顯減弱。5.0mmol.L-1GS誘導(dǎo)72h分別轉(zhuǎn)染CatDsiRNA和Bcl-XLsiRNA組中，CatD與Bcl-XL的共定位信號CatD相對增強。與轉(zhuǎn)染的K562細胞相比，GS誘導(dǎo)凋亡前后CatD蛋白表達增加而Bcl-XL蛋白表達未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1．成功構(gòu)建氨基葡萄糖硫酸鹽誘導(dǎo)慢性髓性白血病的凋亡模型。5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細胞凋亡作用明顯；
　　2．5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的

7、凋亡細胞CatD與Bcl-XL的共定位信號明顯增強。而CatD蛋白表達增加，Bcl-XL蛋白表達減少。在PepstatinA抑制CatD后，再用5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)與單純的5mmol.L-1的GS誘導(dǎo)的K562細胞，可以看出在PepstatinA抑制后，CatD與Bcl-XL的共定位信號中顯現(xiàn)CatD的信號增強。CatD蛋白表達減少，而Bcl-XL蛋白表達則沒表現(xiàn)出明顯差異。
　　3．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾RNACatD與Bcl-