鹽生海蘆筍及其內(nèi)生真菌Salicorn46次級代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌種類繁多、分布廣泛，且能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和活性多樣性的次級代謝產(chǎn)物，因此已成為發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)化合物的巨大資源寶庫。在內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的研究過程中，傳統(tǒng)的篩選方法是基于活性篩選和化學(xué)篩選或者二者的組合，這些方法最大的缺點(diǎn)就是常常導(dǎo)致已知微生物和已知化合物不斷重復(fù)的發(fā)現(xiàn)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)功能基因的定向篩選方法已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新型化合物的重要策略之一。
　　

2、鹽生海蘆筍(Salicornia bigelovii Torr.)生長在高鹽環(huán)境中，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎與活性多樣的化合物，而且研究證實(shí)鹽生海蘆筍中蘊(yùn)藏著多種內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌往往能夠產(chǎn)生多種活性次級代謝產(chǎn)物。
　　本研究利用有機(jī)溶劑對鹽生海蘆筍進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯提取物;采用硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠柱層析等分離手段對其分離純化，得到4個(gè)單體化合物;通過現(xiàn)代波譜學(xué)方法及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對確定了這些單體化合物的結(jié)

3、構(gòu)分別為:oleicaicd(1)、(3β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,9,22-trien-3-ol(2)、pentadecyl ferulate(3)和scopoletin(4)。
　　采用PDA平板法和斜面法從鹽生海蘆筍中分離純化出兩株編號(hào)分別為Salicorn54和Salicom46的內(nèi)生真菌，并利用PCR技術(shù)進(jìn)行真菌Ⅰ型PKS功能基因篩選，在菌株Salicorn46中分離得到1條PK

4、S KS基因片段，BLAST比對結(jié)果表明該基因序列與GenBank里已知的生物合成相關(guān)的PKS基因有較高相似性(90-95％)。通過系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該P(yáng)KS KS序列獨(dú)成一枝，提示該菌株可能具有產(chǎn)生新的聚酮化合物的潛力。
　　利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法將Salicorn54和Salicorn46分別鑒定為甜菜蛇眼莖點(diǎn)菌Phoma betae和柑桔青霉菌Penicillium citrinum。
　　對菌株Salic

5、orn46進(jìn)行大量發(fā)酵、溶劑萃取、柱層析分離純化得到8個(gè)單體化合物，利用核磁共振、紅外、紫外、質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用等波譜學(xué)手段鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為:penieitriketo(5)、ergone(6)、(3β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,9,22-trien-3-ol(7)、(3β,5a,8a,22E)-5,8-epidioxyergosta-6,22-dien-3-ol(8)、stigmasta-7,2

6、2-diene-3β,5α,6α-triol(9)、3β,5α-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6β-yl oleate(10)、Nb-acetyltryptamine(11)和2-(1-oxo-2-hydroxyethyl) furan(12)。
　　采用DPPH法對分離得到的12個(gè)單體化合物進(jìn)行抗氧化活性初步評價(jià)。結(jié)果表明:這12個(gè)單體化合物均能在一定程度上清除DPPH自由基，但清除

7、能力相差較大。其中，化合物3和5清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，且與陽性對照VE的DPPH自由基清除活性最為接近。
　　采用8種指標(biāo)菌對分離得到的單體化合物進(jìn)行抑菌活性篩選，結(jié)果為:化合物6-10都表現(xiàn)出了不同程度的抑菌活性，其中化合物6表現(xiàn)出明顯的廣譜抑菌活性，能抑制白色念珠菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、恥構(gòu)分枝桿菌以及草分枝桿菌的生長，MIC值分別為25.5±0.48、25.5±0.25、18.5±0.34和51.0±0.68μM?；衔?