Linker長(zhǎng)度對(duì)MDC和CVB3VP1融合基因疫苗免疫效果的影響.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組3型(Coxsackievirus group B type3，CVB3)是導(dǎo)致人類急、慢性心肌病的重要病原一。其預(yù)防和治療性疫苗的研究極為迫切。VP1是CVE二主要的衣殼蛋白，含有多個(gè)T、B細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。國(guó)內(nèi)外研究表明，編碼VP1的DNA疫苗，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)感染小鼠具有一定的保護(hù)能力，但不能有效阻止致死量病毒感染。研究證明，一些細(xì)胞因子作為基因佐劑，可大大提高DNA疫苗的

2、免疫效應(yīng)。本室構(gòu)建了MDC(macrophage-derived chemokine，MDC)與CVB3VP1融合基因質(zhì)粒，保護(hù)率有一定的提高，但不能達(dá)到實(shí)用程度。推測(cè)可能是融合蛋白中某一成分或兩種成分發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的不利變化，影響與APCs結(jié)合和/或VP1蛋白的免疫原性。如何保證融合蛋白的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性是本研究探討的問題。 接頭序列(Linker)的介入是基因融合技術(shù)之一，即通過一段適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來

3、，使之在適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)表達(dá)成為一條單一的肽鏈，其中起連接作用的氨基酸稱為L(zhǎng)inker。Linker的選擇對(duì)構(gòu)建有功能活性的融合蛋白是至關(guān)重要的。它的存在有利于蛋白質(zhì)兩側(cè)功能區(qū)的正確折疊，以允許形成各自獨(dú)立的構(gòu)象。長(zhǎng)度和組成是選擇Linker時(shí)主要應(yīng)考慮的問題。研究表明，親水性強(qiáng)和柔性好的Linker是構(gòu)建融合蛋白的首選。故甘氨酸(glycine，Gly，G )和絲氨酸(serine，Ser，S)是構(gòu)建Linker的常用氨基酸。G 是所有

4、氨基酸中分子量最小，沒有手性碳，所以柔性最好，S 是親水性最強(qiáng)的氨基酸，能增加親水性。Linker的長(zhǎng)度過長(zhǎng)，在融合蛋白的生產(chǎn)過程中對(duì)蛋白酶比較敏感，導(dǎo)致活性融合蛋白的產(chǎn)量減低，應(yīng)用較短的Linker，可以克服重組蛋白酶分解的問題，但可能使兩個(gè)分子距離太近導(dǎo)致蛋白功能的喪失。據(jù)資料顯示10-22個(gè)氨基酸效果較好。故本研究引入長(zhǎng)度為10、15、19個(gè)由G和S組成的Linker來構(gòu)建表達(dá)MDC與CVB3VP1融合蛋白核酸疫苗。 方法

5、：(1)用PCR方法分別擴(kuò)增出帶Linker的MDC-L15(用于構(gòu)建Linker長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的融合蛋白)、MDC-L19(用于構(gòu)建Linker長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸的融合蛋白)、L15-VP1(用于構(gòu)建Linker長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的融合蛋白)和L19-VP1(用于構(gòu)建Linker長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸的融合蛋白)片段；(2)將4種基因的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，接種含Amp的2YT培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒

6、定和測(cè)序篩選重組子；(3)經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)后，用合適的核酸內(nèi)切酶從這4種克隆載體切取目的基因片段。將目的基因片段MDC-L15和L15-VP1與經(jīng)合適限制性內(nèi)切酶酶切的pcDNA3載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/MDC-L15-VP1。同樣的方法構(gòu)建pcDNA3/MDC-L19-VP1。(4)用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5 α大腸桿菌中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/MDC-L19-VP1、pcDNA3/MDC-L15-VP1、pc

7、DNA3/MDC-L10-VP1、pcDNA3/VP1和pcDNA3，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行純化；(5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將 6周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組14只；5組分別為pcDNA3組、pcDNA3/VP1組、pcDNA3/MDC-L10-VP1組、pcDNA3/MDC-L15-VP1組和pcDNA3/MDC-L19-VP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100μg，每4周免疫1次，

8、共免疫3次；于2、6、10周，眼眶靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)(固定病毒.稀釋血清法)檢測(cè)血清中CVB3特異性中和抗體。第3次免疫后3周，每組3只小鼠取脾臟用于檢測(cè)細(xì)胞免疫水平，每組8只小鼠用5LD<,50>的CVB3腹腔內(nèi)攻擊，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天。每組剩余的3只小鼠用3 LD<,50>CVB3攻擊，注射病毒后第7天取血，分離血清進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。處死后，取心臟，制備石蠟切片，HE染色，觀察各組小鼠心肌病理學(xué)改

9、變。 結(jié)果：(1)PCR擴(kuò)增出MDC-L15、MDC-L19、L15-VP1和L19-VP1基因片段，基因片段的長(zhǎng)度與預(yù)期值相符。(2)成功構(gòu)建了原核克隆載體pGEM-T/MDC-L15，pGEM-T/MDC-L19，pGEM-T/L15-VP1和pGEM-T/L19-VP1，DNA測(cè)序證實(shí)目的基因序列與Genbank登錄序列相同。(3)基因片段插入pcDNA3后酶切結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了pcDNA3/MDC-L15-VP1和pc

10、DNA3/MDC-L19-VP1。(4)不同免疫次數(shù)，各組血清中和抗體的平均效價(jià)分別為：pcDNA3/VP1組1：7.07，1：10.59，1：25.20；pcDNA3/MDC-L10-VP1組1：7.93，1：22.45，1：31.74；pcDNA3/MDC-L15-V P1組1：8.91，1：23.78，1：39.99：pcDNA3/MDC-L9-VP1組1：10.00，1：25.20，1：50.39；pcDNA3組各次平均效價(jià)均低

11、于1：5。pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-L10-VP1、pcDNA3/MDC-L15-VP1和pcDNA3/MDC-L19-VP1組中和抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而提高，經(jīng)單因素方差分析差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第三次免疫后，除pcDNA3/VP1組和pcDNA3/MDC-L10-VP1組無顯著性差異，其余各組兩兩比較均有顯著性差異(P<0.01)。(5)特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨Linker長(zhǎng)

12、度的增加增殖能力和殺傷活性顯著增強(qiáng)，pcDNA3/MDC-L19-VP1組和其它各組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 (6)用5LD<,50>攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：pcDNA3/MDC-L-15-VP1組和pcDNA3/MDC-L19-VP1組均為37.5％，pcDNA3/MDC-L10-VP1組25.0％，pcDNA3/VPI組12.5％，pcDNA3組11天內(nèi)全部死亡。(7)隨Linker長(zhǎng)度的增加血中病毒滴度依

13、次降低，pcDNA3/MDC-L19-VP1組小鼠和其它各組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(8)心肌病理學(xué)檢查隨Linker長(zhǎng)度的增加心肌病理改變依次減輕，但并無明顯異。 結(jié)論：(1)用PCR方法成功擴(kuò)增MDC-L15、MDC-L19、L15-VP1和L19-VP1基因片段。(2)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MDC-L15-VP1、pcDNA3/MDC-L19-VP1。(3)用5LD50的CVB3攻擊后，小鼠的生存率隨著Lin

14、ker長(zhǎng)度的加長(zhǎng)有一定的提高。(4)小鼠血清中和抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高，第三次免疫后pcDNA3/MDC-L19-VP1組中和抗體滴度最高，與其它各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pcDNA3/MDC-L19-VP1組增殖指數(shù)和殺傷率最高，與其它各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6)中和抗體滴度、細(xì)胞免疫檢測(cè)、血中病毒滴度、和心肌切片病理學(xué)分析結(jié)果一致，說明融合基因疫苗pcDNA3/MD