免疫途徑、劑量和佐劑對CVB3VP1蛋白免疫效果的影響.pdf

1、目的：柯薩奇病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。其中B組3型（Coxsackievirus group B type3，CVB3）所致的病毒性心肌炎嚴(yán)重危害人類健康，也是兒童和青少年猝死的重要原因，迄今尚無有效的預(yù)防手段。VP1是CVB3主要的衣殼蛋白，含有多個(gè)T、B細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
　　 基因工程亞單位疫苗是將目的基因克隆到原核或真核表達(dá)載體中，在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)純化制備的疫苗。亞單位疫苗具有較強(qiáng)的免疫

2、原性，成分單一，可顯著提高抗體水平，免除非抗原成分引起的副作用，保證疫苗的安全性。本室前期將VP1基因克隆到原核表達(dá)載體，在大腸桿菌成功表達(dá)了VP1蛋白，經(jīng)純化后免疫小鼠。結(jié)果顯示VP1蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但未能達(dá)到滿意的保護(hù)效果。因此，進(jìn)一步增強(qiáng)VP1蛋白的免疫原性，提高CVB3特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，已成為倍受關(guān)注的研究方向。
　　 有多種因素影響機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度及類型，主要是抗原物質(zhì)本

3、身的性質(zhì)和進(jìn)入機(jī)體的途徑、劑量、次數(shù)、免疫間隔時(shí)間以及免疫佐劑的類型等。本研究用原核細(xì)胞表達(dá)得到純化CVB3VP1蛋白，選取3種常用免疫途徑，3種免疫劑量，聯(lián)合3種免疫佐劑共同免疫小鼠。觀察不同免疫途徑，不同劑量和不同佐劑對免疫效果的影響。
　　 方法：
　　 1.將我室構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21（DE3）pLysS，誘導(dǎo)表達(dá)攜帶有6×HIS標(biāo)簽的VP1蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Wes

4、tern-blot鑒定。
　　 2.將大量誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體在冰浴中超聲破碎，分離上清和包涵體沉淀，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明蛋白以包涵體形式存在，用尿素溶解沉淀，利用金屬鎳離子親和層析柱純化目的蛋白，透析后濃縮蛋白。
　　 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：分二期進(jìn)行。第一期將小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為腹腔注射組、皮下注射組、肌肉注射組。純化后的蛋白以PBS稀釋后，經(jīng)過腹腔、頸背部皮下和股四頭肌注射免疫小鼠。初次免疫加完全弗

5、氏佐劑，以后免疫用不完全弗氏佐劑。每次每只接種100μg；每3周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）檢測血清中CVB3特異性中和抗體的水平；用純化VP1抗原包被酶聯(lián)板，采用ELISA方法檢測小鼠血清抗體IgG抗體效價(jià)。經(jīng)過比較選擇最佳免疫注射途徑，進(jìn)行第二期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　 4.第二期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組18只。純化后的蛋

6、白以PBS稀釋后，采用肌肉注射途徑免疫，①低劑量注射組：每次每只接種50μg。②中劑量注射組：每次每只接種100μg。③高劑量注射組：每次每只接種150μg。以上3組初次免疫加完全弗氏佐劑，以后免疫用不完全弗氏佐劑。④氫氧化鋁佐劑組：每次每只接種100μg。⑤ISA720組：每次每只接種100μg。⑥PBS組。每3周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）檢測血清中CVB3

7、特異性中和抗體的水平；用純化VP1抗原包被酶聯(lián)板，采用ELISA方法檢測小鼠血清特異性抗體效價(jià)。第3次免疫后3周，每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法進(jìn)行特異性淋巴細(xì)胞增殖活性和特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）殺傷活性的檢測；另每組12只小鼠用致死量的CVB3（4LD50）進(jìn)行腹腔注射，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后

8、第21天：每組剩余的3只小鼠用CVB3（3LD50）攻擊，注射病毒后第7天處死，用于血中病毒滴度的測定。
　　 結(jié)果：
　　 1.SDS-PAGE和Western-blot證實(shí)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3）pLysS成功表達(dá)了CVB3 VP1蛋白，蛋白主要以包涵體形式存在。
　　 2.不同免疫途徑各組各次免疫后血清中和抗體滴度分別為：腹腔注射組：1：7.08，1：28.18，1

9、：42.66；皮下注射組：1：7.08，1：11.22，1：35.48；肌肉注射組：1：8.91，1：47.86，1：70.79。血清特異性IgG抗體分別為：皮下注射組：1：155，1：7600，1：11800；腹腔注射組1：240，1：8300，1：17000；肌肉注射組1：425，1：22400，1：38400。單因素方差分析表明，三次免疫后，各組中和抗體和特異性IgG抗體滴度逐次增加（P<0.05）。三次免疫后，中和抗體和特異性I

10、gG抗體：肌肉注射組>腹腔注射組>皮下注射組（P<0.01）。
　　 3.經(jīng)肌肉注射途徑免疫后，不同劑量各組血清中和抗體效價(jià)分別為：低劑量組：1：6.31，1：42.66，1：47.86；中劑量組：1：7.08，1：44.67，1：63.10；高劑量組：1：7.08，1：50.12，1：70.79。血清特異性IgG水平：低劑量組：1：200，1：6400，1：19200；中劑量組：1：398，1：21000，1：36300；高劑

11、量組：1：425，1：23040，1：51200。單因素方差分析表明，三次免疫后，各組中和抗體和特異性IgG抗體滴度逐次增加（P<0.05）。末次免疫后各組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中和抗體和特異性IgG抗體：高劑量組>中劑量組>低劑量組（P<0.05）。
　　 4.不同佐劑組各次免疫后血清中和抗體滴度為：氫氧化鋁佐劑組：1：5.62，1：12.59，1：26.92；弗氏佐劑（中劑量）組：1：7.08，1：44.67，1：63.10

12、；ISA720佐劑組：1：8.91，1：44.67，1：85.11。各次免疫后血清特異性IgG水平：氫氧化鋁佐劑組：1：150。1：1600，1：11800；弗氏佐劑（中劑量）組：1：398，1：21000，1：36300； ISA720佐劑組：1：280，1：12800，1：38400。單因素方差分析表明，三次免疫后，各組中和抗體和特異性IgG抗體滴度逐次增加（P<0.05）。末次免疫后各組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中和抗體：ISA720

13、佐劑組>弗氏佐劑組>氫氧化鋁佐劑組（P<0.05）。特異性IgG抗體：ISA720組和弗氏佐劑組高于氫氧化鋁佐劑組，（P<0.05）弗氏佐劑組和ISA720組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>O.05）。
　　 5.小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性，以CVB3或ConA刺激，各組均高于PBS組（P<0.05）；以CVB3刺激，高劑量組高于低劑量組和中劑量組（P<0.05）； ISA720佐劑組高于弗氏佐劑組和氫氧化鋁佐劑組（P<0.05）。ConA

14、刺激時(shí)，各組均顯著高于PBS組（P<0.05）。各組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.小鼠脾臟特異性CTL殺傷活性，各組均顯著高于PBS組（P<0.05）；高劑量組高于中劑量組和低劑量組（P<0.05）；弗氏佐劑組和ISA720組高于氫氧化鋁組（P<0.05）。
　　 7.用4LD50攻擊小鼠，PBS組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、氫氧化鋁佐劑組、ISA720佐劑組的21天生存率分別為：0、66.67％、66.67％、

15、50％、33.33％和50％。經(jīng)x2檢驗(yàn)分析，各組之間無明顯差異（P>0.05）。經(jīng)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析表明，各組生存率曲線分布有差別（P<0.05）。低劑量組和中劑量組的生存時(shí)間好于高劑量組，弗氏佐劑組生存時(shí)間好于氫氧化鋁佐劑組（P<0.05）。8各組血清病毒滴度均比PBS組低（P<0.05）。單因素方差分析顯示，高劑量組血中病毒滴度低于低、中劑量組（P<0.05）；ISA720佐劑組低于氫氧化鋁組（P<0.05）。

16、
　　 結(jié)論：
　　 1.成功在原核細(xì)胞表達(dá)了CVB3 VP1蛋白，并進(jìn)行了純化。
　　 2.三種免疫途徑接種，各組血清中和抗體和IgG抗體滴度均隨免疫次數(shù)的增加而提高，肌肉免疫能誘導(dǎo)更高的體液免疫水平。
　　 3.采用肌肉注射途徑免疫，中和抗體和IgG抗體水平隨免疫劑量增加而提高。用致死量病毒攻擊后，病毒載量隨免疫劑量增加而降低，但低劑量組的生存時(shí)間好于其他劑量組。
　　 4.三種佐劑比較，弗氏