CVB3 2A蛋白酶對蛋白翻譯的影響.pdf

1、目的構(gòu)建CVB32A蛋白酶的真核表達載體和缺失突變體，觀察2A及缺失突變體對細胞蛋白翻譯的影響。探討CVB3病毒的蛋白酶2A對真核細胞帽樣蛋白翻譯途徑和內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)翻譯途徑的影響。
　　方法利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突變體質(zhì)粒，將CVB3-2A對真核細胞蛋白翻譯的影響機制:
　　1.Western Blot檢測pcDNA3.1-CVB3-2A與CVB3病毒對細胞內(nèi)eIF4G

2、I和PABPI表達的影響;
　　2.Western Blot檢測pcDNA3.1-CVB3-2A缺失突變體對細胞內(nèi)eIF4GI表達的影響;
　　3.將pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突變體質(zhì)粒分別與表達綠色熒光蛋白(GFP)的pEGFP-n1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在倒置顯微鏡下，觀察GFP的表達量;
　　4.將pcDNA3.1-CVB3-2A與帽樣結(jié)構(gòu)依賴的熒光素酶蛋白(luciferase)的pGL3-F-luc質(zhì)粒共

3、轉(zhuǎn)染，檢測熒光素酶的活性;
　　5.將pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突變體質(zhì)粒分別與表達GFP的pIRES-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在倒置顯微鏡下，觀察GFP的表達量;
　　6.將pcDNA3.1-CVB3-2A及其缺失突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，利用免疫熒光技術(shù)制備好標本片，通過共聚焦顯微鏡觀察2A及其突變體入核的情況。
　　結(jié)果
　　1.CVB32A蛋白酶的真核表達載體pcDNA3.1-CVB3-2A質(zhì)粒和CVB

4、3病毒，均能引起細胞內(nèi)eIF4GI的降解;CVB3病毒也能導(dǎo)致PABPI降解，而pcDNA3.1-2A對PABPI無明顯作用;
　　2.CVB32A蛋白酶的4個缺失突變體對細胞內(nèi)eIF4GI均無明顯作用;
　　3.CVB32A蛋白酶的真核表達載體pcDNA3.1-CVB3-2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞可抑制pEGFP-N1質(zhì)粒表達的帽樣依賴的GFP表達，而4個缺失突變體對GFP的表達量無影響;
　　4.CVB32A蛋白酶的真核表達

5、載體pcDNA3.1-CVB3-2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞可抑制轉(zhuǎn)染pGL3-F-luc質(zhì)粒的酶活性;
　　5.CVB32A蛋白酶的真核表達載體pcDNA3.1-CVB3-2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞導(dǎo)致pIRES-GFP質(zhì)粒表達的GFP表達量增加。而4個缺失突變體對GFP的表達量無影響;
　　6.CVB32A蛋白酶的真核表達載體pcDNA3.1-CVB3-2A質(zhì)粒與其它三個缺失突變體均表達在細胞質(zhì)，而pcDNA3.1-2A C端缺失有明顯入核現(xiàn)