CVB3VP1阻滯Hela細(xì)胞于G1-S期的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究CVB3 VP1蛋白與宿主蛋白MAT1的相互作用對(duì)細(xì)胞功能的影響，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期素（Cyclin D1、Cyclin E1等），細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶（CDK4、CDK2等），細(xì)胞周期抑制基因p21以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白R(shí)b的表達(dá)水平，探討VP1將Hela細(xì)胞阻滯于G1/S期的分子機(jī)制，為研究CVB3的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出VP1-D8（3044-3319bp

2、）和VP1-D4（2459-2926bp，陰性對(duì)照）基因，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1-D4和pBudCE4.1-VP1-D8，雙酶切鑒定并DNA測(cè)序驗(yàn)證。
　　2.運(yùn)用免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒對(duì)Hela細(xì)胞MAT1表達(dá)量的影響。
　　3.利用流式

3、細(xì)胞儀分析以上四種質(zhì)粒對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響。
　　4. Quantative Real-Time RT-PCR檢測(cè)以上四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期G1期檢查點(diǎn)基因：CDK4、CyclinD1、CDK2、Cyclin E1、CDC25A、p21的mRNA表達(dá)情況。
　　5. Quantative Real-Time RT-PCR檢測(cè)CVB3感染Hela細(xì)胞3h、6h、9h后，細(xì)胞周期G1期檢查點(diǎn)基因mRNA表

4、達(dá)水平。
　　6.運(yùn)用免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)以上四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后，非磷酸化Rb、p-Rb Ser795、p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果顯示 pBudCE4.1-VP1-D4和pBudCE4.1-VP1-D8構(gòu)建成功；
　　2.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-

5、VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組 MAT1表達(dá)量較pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　3.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞2

6、4 h后，經(jīng)流式檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果表明pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組 G1期細(xì)胞數(shù)明顯高于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　4.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后，Quantative Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示：C

7、DK4、CDK2、Cyclin D1在pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量明顯低于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而p21呈相反的結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CDC25A、Cyclin E1在四個(gè)轉(zhuǎn)染組均無(wú)明顯變化；
　　5.CVB3感染Hela細(xì)胞3h、6h、9h后，Quantative Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示：CDK4、Cyclin D1

8、、CDK2的表達(dá)量在CVB3感染Hela細(xì)胞3 h下降明顯；p21的表達(dá)量隨CVB3感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　6.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811在pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-

9、D8轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量明顯低于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而非磷酸化Rb呈相反的結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p-Rb Ser-795位點(diǎn)的磷酸化水平在四個(gè)轉(zhuǎn)染組均無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　本論文提示：
　　1. CVB3感染細(xì)胞后，通過(guò)VP1-D8與MAT1蛋白相互作用引起MAT1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致CAK活性降低，而活性減弱的CAK使得CDK4、Cyclin D1、CDK2等基因表達(dá)下調(diào)