AKAP95和Cx43蛋白共同調(diào)控細胞G1-S期轉(zhuǎn)換的機制研究.pdf

1、本研究分為兩部分，第一部分采用免疫組織化學(xué)實驗，包括肺癌組織中AKAP95和Cyclin D3、Akt蛋白表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系及3種蛋白之間的關(guān)聯(lián)性分析、直腸癌組織中AKAP95、CyclinD1、Cyclin E1和Cx43蛋白的關(guān)聯(lián)性分析。通過檢測51例肺癌組織和15例癌旁組織中細胞周期蛋白D3(CyclinD3)、蛋白激酶A錨定蛋白95(AKAP95)和絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt，

2、亦稱蛋白激酶B，PKB)的表達發(fā)現(xiàn)，AKAP95、Cyclin D3和Akt蛋白在肺癌組織中呈高表達，均高于癌旁組織，提示三者在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用;CyclinD3蛋白的表達與肺癌組織的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型和分化程度均無關(guān)，Akt蛋白表達與肺癌組織的分化程度有關(guān);AKAP95蛋白和Cyclin D3蛋白表達，以及AKAP95蛋白和Akt蛋白表達呈關(guān)聯(lián)性;Cyelin D3與Akt蛋白表達之間在肺癌組織中未見關(guān)聯(lián)性。同樣采用免疫

3、組化方法檢測50例直腸癌組織和16例癌旁組織中AKAP95、細胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)以及間隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)的表達發(fā)現(xiàn)，AKAP95、Cyclin E1和Cyclin D1蛋白在直腸癌組織與癌旁組織相比均呈高表達，提示三者可能與直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān);AKAP95和Cylin E1蛋白、Cyclin E1和CyclinD1蛋白、CyclinE1.和Cx43蛋

4、白，以及Cyclin D1和Cx43蛋白之間在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能有協(xié)同作用。另外在直腸癌組織中，AKAP95、Cyclin E1、Cyclin D1和Cx43蛋白的表達在不同的分化程度、組織學(xué)類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)指標(biāo)均未見統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第二部分為細胞生物學(xué)實驗，選取肺腺癌細胞A549作為研究對象，將pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-RNAi-Cx43、pcDNA3.1(+)-Cx43、pcDNA3.

5、1(+)-AKAP95、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-RNAi-AKAP95質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到肺腺癌A549細胞中，Western Blot實驗檢測相關(guān)蛋白的表達，以及分析與Cx43、AKAP95的關(guān)系。結(jié)果顯示:1.AKAP95蛋白表達升高時Cyclin E1和CyclinD1蛋白表達上升，CDK4表達降低，CDK2表達略微降低，并能抑制Cyclin D1蛋白位點Thr286的磷酸化，卻能提高CDK2活性，提示AKAP95蛋

6、白能抑制Cyclin D1蛋白的降解，并可以通過提高Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達以及提高CDK2活性，從G1期早期開始到G1/S期發(fā)揮促進細胞周期進程的作用;Cx43蛋白表達升高時Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達下降，CDK4、CDK2表達提高，并能促進Cyclin D1蛋白位點Thr286的磷酸化，而CDK2活性受到抑制，提示Cx43蛋白能促進Cylin D1蛋白的降解，并可以通過降低Cyclin D1

7、和Cyclin E1蛋白以及抑制CDK2活性，從G1期早期開始到G1/S期發(fā)揮抑制細胞周期進程的作用。2.AKAP95蛋白能促進Rb蛋白的表達，并可以促進位點Ser780和Ser795的磷酸化，對位點Ser567的磷酸化未見影響;Cx43蛋白能抑制Rb蛋白的表達，并可以抑制位點Ser780、Ser795和Ser567的磷酸化。提示AKAP95蛋白能促進Rb蛋白表達，并能促進Rb蛋白早期Ser795和中期Ser780位點的磷酸化，但并不能

8、通過磷酸化Ser567位點的來促進Rb蛋白的完全活化;Cx43蛋白能抑制Rb蛋白表達，并能抑制Ser795、Ser780和Ser567位點的磷酸化，在整個Rb蛋白磷酸化過程中均起到抑制作用。3.除了對Rb蛋白Ser567位點的磷酸化作用不同，AKAP95和Cx43蛋白對上述蛋白呈現(xiàn)相反作用，并且AKAP95和Cx43質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果證明共轉(zhuǎn)染時AKAP95和Cx43蛋白對上述蛋白的作用是單獨轉(zhuǎn)染作用的疊加，而細胞G1期到有絲分裂中期A

9、KAP95和Cx43蛋白處于結(jié)合狀態(tài)，提示AKAP95和Cx43蛋白通過AKAP95-Cx43復(fù)合物的作用共同調(diào)節(jié)細胞周期進程。4.AKAP95蛋白能抑制Akt蛋白表達，并能通過抑制Akt位點Ser473的磷酸化來抑制Akt蛋白的完全活化;而Cx43蛋白能促進Akt蛋白表達，并能促進位點Ser473磷酸化，進而促進Akt蛋白的完全活化。結(jié)合之前的研究Akt能促進Cx43蛋白的磷酸化而抑制Cx43蛋白活性、提高細胞進程，以及G1末期到有絲