白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:糖尿病心腦血管病變是糖尿病的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死的最主要原因。心腦血管病變的發(fā)生與長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)關(guān)系密切，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向內(nèi)膜遷移并在內(nèi)膜增殖則在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一組依賴于金屬

2、離子的蛋白水解酶家族，能廣泛降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，在AS斑塊形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。其中有關(guān)MMP-2、MMP-9的研究是目前的熱點(diǎn)，無(wú)論是糖尿病患者臨床研究、糖尿病動(dòng)物模型，還是高糖作用于體外培養(yǎng)的VSMCs都有顯示MMP-2、MMP-9表達(dá)及活性的增加，可見(jiàn)MMPs在糖尿病大血管病變發(fā)生中起著重要作用，但是高糖激活MMPs發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不十分明確。
　　 白藜蘆醇(res

3、veratrol，Res)是近年來(lái)研究較多的一種植物抗毒素，具有廣泛的生物和藥理學(xué)作用，除具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗衰老、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)等作用外，還可以通過(guò)抑制VSMCs的增殖遷移，發(fā)揮抗AS作用，從而對(duì)心血管起到保護(hù)作用。目前有關(guān)白藜蘆醇能否通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9活性表達(dá)而達(dá)到抗AS作用的研究并不多，本研究通過(guò)應(yīng)用白藜蘆醇和PI3K特異性抑制劑Ly294002作用于高糖體外培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，

4、觀察MMP-2、MMP-9表達(dá)和活性變化及p-Akt、Akt蛋白表達(dá)情況，探討高糖引起MMPs表達(dá)及活性變化是否與PI3K信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)探討白藜蘆醇可能的作用機(jī)制，為糖尿病大血管病變?cè)缙诜乐翁峁┬掳悬c(diǎn)，也為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):以大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株A7r5(細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)培養(yǎng)物典藏中心)為研究對(duì)象。將凍存的血管平滑肌細(xì)胞株迅速投入37℃溫水中，同時(shí)搖動(dòng)凍存管使之

5、快速解凍，解凍后800r/min離心5min，棄上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5ml混勻，接種于培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5％CO2孵箱中孵育，待細(xì)胞鋪滿瓶底的90％后進(jìn)行傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別接種于50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)48h，更換于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組如下:
　　 ①正常對(duì)照組(NG組，含5.5mmol/L葡萄糖)
　　 ②高糖培養(yǎng)組(HG組，含25mmol/L葡萄糖)

6、>　　 ③NG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)
　　 ④HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)
　　 ⑤NG+Res組(25、50、100μmol/L)
　　 ⑥HGRes組(25、50、100μmol/L)
　　 2、應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組VSMCs增殖活性;
　　 3、應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)各組MMP-2、MMP-9表達(dá);
　　 4、應(yīng)用明膠酶譜法檢

7、測(cè)各組MMP-2、MMP-9活性;
　　 5、應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)各組p-Akt和總Akt蛋白表達(dá)，其中p-Akt表示活化的Akt。
　　 結(jié)果:
　　 1、用MTT法檢測(cè)VSMCs的增殖活性，結(jié)果顯示:HG組VSMCs增殖顯著(0.513±0.007)，增殖活性明顯高于NG組(0.357±0.009，P＜0.05)，HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)VSMCs增殖活性分別為0

8、.421±0.016、0.402±0.017、0.373±0.022，HG+Res組(25、50、100μmol/L)增殖活性分別為0.474±0.023、0.438±0.031、0.386±0.013，二者均可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖(P＜0.05)，且均呈劑量依賴性;而NG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)VSMCs增殖活性分別為0.382±0.010、0.382±0.013、0.382±0.012，NG+

9、Res組(25、50、100μmol/L)VSMCs增殖活性分別為0.380±0.024、0.380±0.027、0.381±0.022，與NG組比較均無(wú)明顯改變(P＞0.05）。
　　 2、用免疫組化方法檢測(cè)VSMCs中MMP-2、MMP-9表達(dá)情況，結(jié)果顯示:HG組MMP-2和MMP-9的表達(dá)分別為0.380±0.024、0.363±0.052，均較NG組明顯升高(0.240±0.015、0.204±0.021，P＜0.05

10、);HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)MMP-2的表達(dá)分別為0.323±0.044、0.282±0.026、0.248±0.013，MMP-9的表達(dá)分別為0.302±0.040、0.256±0.024、0.245±0.014，均較HG組明顯降低(P＜0.05），且均呈劑量依賴性;HG+Res組(25、50、100μmol/L)MMP-2的表達(dá)分別為0.301±0.011、0.270±0.019、0.252±0.01

11、7，MMP-9的表達(dá)分別為0.322±0.030、0.280±0.019、0.247±0.009，均較HG組明顯降低(P＜0.05），且呈劑量依賴性;除HG+Res(100μmol/L)MMP-2表達(dá)水平與NG組無(wú)差異外（P＞0.05），其余各組MMP-2和MMP-9表達(dá)水平仍高于NG組（P＜0.05）。
　　 3、用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2及MMP-9活性變化，結(jié)果顯示:HG組MMP-2和MMP-9的活性分別為8969.000

12、±201.968、9339.667±128.469，均較NG組明顯升高(2599.000±88.476、2677.667±146.302，P＜0.05);HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)MMP-2的活性分別為5962.667±211.316、4997.000±117.758、3792.333±137.012，MMP-9的活性分別為7574.333±101.041、6233.000±158.206、4741.667

13、±80.432，均較HG組明顯降低(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，但仍高于NG組MMP-2、MMP-9的活性(P＜0.05);HG+Res組(25、50、100μmol/L)MMP-2的活性分別為7435.333±163.369、6209.667±195.372、5502.667±70.316,MMP-9的活性分別為8440.667±148.008、7889.333±155.828、6541.000±55.018，均較HG組明顯降低(

14、P＜0.05），且呈劑量依賴性，但仍高于NG組MMP-2、MMP-9的活性(P＜0.05）。
　　 4、用Westernblot技術(shù)檢測(cè)p-Akt及總Akt蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示:NG組、HG組總Akt表達(dá)分別為0.701±0.013、0.705±0.015，兩組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05);HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)總Akt表達(dá)分別為0.678±0.021、0.682±0.015、0.674±0

15、.012，同NG組、HG組比較，無(wú)明顯差異性(P＞0.05）;而HG+Res組(25、50、100μmol/L)總Akt的表達(dá)分別為0.530±0.016、0.534±0.016、0.532±0.017，同NG組、HG組比較有所降低(P＜0.05），但沒(méi)有劑量依賴性;HG組的p-Akt表達(dá)為0.583±0.017，明顯高于NG組(0.085±0.009，P＜0.05)，HG+Ly294002組(10、20、30μmol/L)p-Akt表

16、達(dá)分別為0.404±0.017、0.244±0.016、0.126±0.017，HG+Res組(25、50、100μmol/L)p-Akt表達(dá)分別0.500±0.018、0.449±0.016、0.361±0.016，均低于HG組，說(shuō)明二者均可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的p-Akt表達(dá)（P＜0.05），且呈劑量依賴性，但都仍高于NG組(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)MMP-2和