氨基葡萄糖對(duì)EAE大鼠MMP-2、MMP-9及BBB影響的研究.pdf

1、目的：使用不同劑量氨基葡萄糖(glucosamine,GS)干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠,觀察血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的功能及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9表達(dá)的變化,考察不同劑量GS對(duì)EAE的治療效果,研究MMP-2、MMP-9與BBB的

2、相互關(guān)系及其在EAE中的作用,探討EAE的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及應(yīng)用GS治療EAE的作用機(jī)制,尋求多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)的有效治療途徑。 方法：制備EAE動(dòng)物模型,用不同劑量GS(90mg/(kg·d)和180mg/(kg·d))治療EAE,按照通用的血分法評(píng)估EAE組、GS1組、GS2組和佐劑組的臨床癥狀,觀察發(fā)病率、平均起始發(fā)病時(shí)間、平均高峰期評(píng)分、體重變化,并于p.i.6、8、10、12、14、

3、16、18天檢測(cè)大鼠血清和腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中白蛋白(albumin,ALB)含量,其CSF與血清ALB比值(albumin quotient,QA)作為評(píng)價(jià)BBB功能及動(dòng)態(tài)變化的指標(biāo)。同時(shí)取大鼠腦和脊髓制成石蠟切片,行HE染色和MMP-2、MMP-9免疫組化染色。 結(jié)果： 1.EAE組、GS1組、GS2組P.i.8d前無(wú)任何癥狀,p.i.8～11d開始出現(xiàn)活動(dòng)減少,食欲減退,體重下

4、降。EAE組于P.i.12d出現(xiàn)臨床癥狀,平均起始發(fā)病時(shí)間為12.24±0.66天,GS治療組于P.i.12-14d出現(xiàn)臨床癥狀,平均起始發(fā)病時(shí)間分別為12.40±0.84天、13.60±1.64天,GS2組與EAE組相比發(fā)病時(shí)間明顯延遲,佐劑組未見發(fā)病。P.i.12d EAE組、GS1組、GS2組的發(fā)病率分別為62.5％、33.3％和9.0％(n=24),臨床癥狀評(píng)分分別為1.17±1.09、0.54±0.88、0.17±0.57。p

5、.i.14d疾病發(fā)展達(dá)高峰期,各組臨床癥狀加重,EAE組、GS1組、GS2組的發(fā)病率分別為77.8％、44.4％和111％(n=18),臨床癥狀評(píng)分分別為2.33±1.57、1.00±1.24、0.33±0.97,此時(shí)三組動(dòng)物體重同p.i.8d相比,平均減輕24.50±8.42g、14.00±7.85g、10.50±5.44g,EAE組較GS治療組減輕更為明顯,而GS2組和GS1組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。P.i.16～18

6、d多數(shù)動(dòng)物臨床癥狀出現(xiàn)緩解甚至消失,體重逐漸增加。實(shí)驗(yàn)中EAE組、GS1組、GS2組平均高峰期評(píng)分分別為2.13±1.70、1.08±1.41、0.50±1.02,行秩和檢驗(yàn)示:EAE組與GS2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.017),EAE組與GS1組、GS2組與GS1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.017)。三組發(fā)病率行X2檢驗(yàn)示:p.i.12～14d EAE組與GS治療組、GS2組與GS1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),p

7、.i.16d EAE組與GS2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。三組臨床癥狀評(píng)分行秩和檢驗(yàn)示:p.i.12～14d EAE組與GS2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.017),p.i.14d EAE組與GS1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.017),p.i.12～14 GS2組與GS1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.017)。 2.EAE組、GS1組、GS2組、佐劑組QA值均出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。EAE組QA值在p.i

8、.6d開始升高,p.i.10d達(dá)最大值(0.32±0.10),明顯早于臨床癥狀出現(xiàn),之后緩慢降低。GS治療組QA值在p.i.6d僅有少量升高,在p.i.14d達(dá)到高峰,同EAE組相比高峰延遲,升高幅度降低。佐劑組QA值在免疫后初期雖有增高,但升高幅度明顯低于EAE組。p.i.6～14d EAE組QA值與GS1組、GS2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p.i.8～14dGS1組QA值與GS2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

9、p.i.6～16d EAE組QA值與佐劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3.MMP-2和MMP-9在EAE組、GS1組、GS2組、佐劑組中的表達(dá)與病理改變和疾病進(jìn)展相一致。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定著色區(qū)積分光密度示:EAE組發(fā)病早期已有MMP-2、-9陽(yáng)性表達(dá),早于臨床癥狀出現(xiàn),p.i.10d MMP-2、-9積分光密度達(dá)最大值,之后表達(dá)逐漸減低。當(dāng)MMP-2、-9表達(dá)增強(qiáng)時(shí),表現(xiàn)為炎細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及袖套樣結(jié)構(gòu)周圍著色

10、加深,其中MMP-9的表達(dá)重于MMP-2,且發(fā)病急、病情重的大鼠表達(dá)更明顯。p.i.6～18d EAE組MMP-2、-9表達(dá)與QA值比較變化趨勢(shì)一致,由線峰值均出現(xiàn)在p.i.10d,即MMP-2、-9表達(dá)最強(qiáng)時(shí),QA值也最大,與BBB的動(dòng)態(tài)性變化相符合,二者相關(guān)性分析表明呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。GS治療組p.i.6d MMP-2、-9可有少量表達(dá),p.i.8～12d表達(dá)逐漸增強(qiáng),p.i.12d時(shí)積分光密度值達(dá)高峰,與EAE組相比表

11、達(dá)高峰延遲,陽(yáng)性染色程度減輕,染色范圍縮小。行方差分析示:p.i.6～16d GS治療組與EAE組MMP-9積分光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p.i.8～14d GS治療組與EAE組MMP-2積分光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)p.i.8～12d GS2組與GS1組MMP-2、-9積分光密度值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論： 1.EAE疾病早期已有BBB的損傷,而且繼BBB損傷達(dá)高峰