大蒜素誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞M期阻滯機(jī)制研究.pdf

1、大蒜是百合科蔥屬植物蒜的鱗莖。流行病學(xué)研究已證實(shí)大蒜具有多種防病抗病功能。大蒜的有效成分主要是一些含硫有機(jī)化合物，其中較典型的一種為大蒜素。大蒜素(allicin)又名蒜素，大蒜新素，大蒜辣素，化學(xué)名二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide)，具有抗感染，降血脂，防治動脈硬化，防止DNA損傷，提高細(xì)胞活力，提高細(xì)胞抗氧化及解毒能力等多種抗病活性。近來的研究還發(fā)現(xiàn)大蒜素具有良好的抗癌、防癌作用。大蒜素的抗腫瘤機(jī)制較多，其中較

2、重要的一種是可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期特異性阻滯。本室前期研究已發(fā)現(xiàn)大蒜素可使人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803細(xì)胞周期阻滯于M期，但這種M期阻滯的機(jī)制尚不清楚。臨床常用的選擇性作用于M期的長春堿類抗腫瘤藥物如長春新堿，是通過破壞微管動力學(xué)的穩(wěn)定性，促進(jìn)微管解聚，阻礙紡錘體形成而使腫瘤細(xì)胞阻滯于M期的。而這種微管動力學(xué)的穩(wěn)定性又是受到有絲分裂促進(jìn)因子MPF即p34<'cdc2>/cyclin B<,1>復(fù)合物通過磷酸化微管相關(guān)蛋白

3、MAP來調(diào)節(jié)的。大蒜素是否與長春堿類藥物一樣，也是通過促進(jìn)微管解聚來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞M期阻滯的?它們促進(jìn)微管解聚的作用是否與MPF的表達(dá)有關(guān)?這些問題尚有待研究。 目的: 本研究采用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察大蒜素和長春新堿處理前后SGC-7901細(xì)胞中微管結(jié)構(gòu)及cyclin B<,1>在胞內(nèi)分布的變化，并定量分析cyclin B<,1>在用藥前后量的改變，旨在揭示大蒜素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞M期阻滯的機(jī)制。

4、方法: 采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行人胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞的培養(yǎng)，以MTT比色法檢測人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率；采用免疫熒光染色方法，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于放置有潔凈無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，分別加入IC50劑量的大蒜素或長春新堿，處理72h或24h后經(jīng)α微管蛋白抗體或cyclin B<,1>抗體間接免疫熒光染色，在CLSM下觀察并拍照。比較大蒜素處理前后M期細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比的變化，觀察細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)及cyc

5、lin B。在胞內(nèi)分布的變化，并利用Leica confocalsoftware軟件定量分析cyclin B<,1>熒光強(qiáng)度在用藥前后的改變。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，以平均熒光強(qiáng)度作為該蛋白的相對表達(dá)量。 結(jié)果: 1．大蒜素和長春新堿對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用在大蒜素IC50藥物濃度(24h為7.2 μ g/ml，72 h為20 μ g/ml)及長春新堿IC50藥物濃度(24h為0.29 μ g/ml，72 h為0.

6、059 μ g/ml)作用下，SGC-7901細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性。 2．α微管蛋白抗體免疫熒光染色經(jīng)IC50劑量大蒜素和長春新堿處理72h后有絲分裂期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分別為30.61％和34.92％，明顯高于對照組的百分?jǐn)?shù)(4.69％)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩處理組間無明顯差別(P>0.05)。大蒜素和長春新堿處理組細(xì)胞中出現(xiàn)一些多核細(xì)胞。對照組細(xì)胞呈多角形、菱形、梭形等正常形態(tài)，可以清楚地看到胞質(zhì)

7、中有完整的條狀或網(wǎng)狀微管結(jié)構(gòu)。而經(jīng)過大蒜素處理后的細(xì)胞與對照細(xì)胞相比大部分明顯變小、變圓，胞質(zhì)中正常的微管結(jié)構(gòu)消失，微管蛋白或凝聚于核周，或彌漫散布。此種改變與長春新堿處理組的改變相似。 3．cyclin B<,1>免疫熒光染色形態(tài)學(xué)及計量學(xué)觀察對照組間期細(xì)胞cyclin B<,1>主要散布于胞質(zhì)，核內(nèi)較少。經(jīng)IC50劑量大蒜素和長春新堿處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞質(zhì)中cyclin B<,1>表達(dá)升高，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，濃聚成團(tuán)。利用軟件

8、定量分析cyclin B<,1>蛋白熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，經(jīng)過大蒜素和長春新堿處理后細(xì)胞內(nèi)cyclin B<,1>蛋白熒光強(qiáng)度均明顯高于對照組細(xì)胞(P<0.001)，兩處理組間差別(P<0.05)遠(yuǎn)不及與對照組間那樣明顯。 結(jié)論: 大蒜素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞M期阻滯的機(jī)制與長春堿類藥物相似，可以促進(jìn)微管解聚，可以提高有絲分裂促進(jìn)因子MPF的重要成份cyclin B<,1>在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于M期。大蒜素可以作為一種新的作