肺炎衣原體Hsp10基因克隆與表達(dá)及誘生炎癥因子和細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的:PCR擴(kuò)增出肺炎衣原體(Cpn)熱休克蛋白10(Hsp10)基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/Hsp10,在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化獲得重組融合蛋白rHsp10。研究該重組蛋白在體外誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)并產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,為進(jìn)一步探索Cpn感染致病的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:針對(duì)Cpn Hsp10基因設(shè)計(jì)引物,以Cpn AR39株基因組DNA為模板, PC

2、R擴(kuò)增目的基因片段,將其插入pUCm-T載體,通過藍(lán)白斑初篩,酶切分析、PCR及測(cè)序鑒定篩選陽性重組體;將Hsp10基因亞克隆至pQE30表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/ Hsp10,然后轉(zhuǎn)化至宿主菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白rHsp10。用不同濃度的rHsp10刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,ELISA檢測(cè)經(jīng)刺激后的RAW264.7

3、細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6水平;以RT-PCR方法分析TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)。以MTT法檢測(cè)經(jīng)rHsp10處理后RAW264.7細(xì)胞的增生或抑制作用,用Hoechst33258熒光染色、DNA片段化分析、細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)經(jīng)rHsp10處理后RAW264.7細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:PCR成功擴(kuò)增出Cpn Hsp10基因片段(309bp),構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30/Hsp10,并在M15菌中高效表達(dá)出Mr約為1

4、5kDa的Hsp10重組融合蛋白,超聲裂解后 SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性形式表達(dá),經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化獲得純度在95％以上的rHsp10。rHsp10能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6的mRNA,并以時(shí)間、劑量依賴方式刺激細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6,當(dāng)rHsp10的濃度為6μg/mL時(shí)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量最多,分別為12.67±0.66ng/mL和3.23±0.28n

5、g/mL;當(dāng)rHsp10刺激RAW264.7細(xì)胞36h時(shí)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量則達(dá)到高峰。另外,rHsp10以劑量依賴方式抑制RAW264.7細(xì)胞增殖。當(dāng)20μg/mL rHsp10處理RAW264.7細(xì)胞24h后,形態(tài)學(xué)上,細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細(xì)胞起泡及凋亡小體等凋亡特征;當(dāng)rHsp10刺激RAW264.7細(xì)胞6h后,即可誘導(dǎo)其發(fā)生早期凋亡,12h后出現(xiàn)晚期凋亡;當(dāng)5μg/mL rHsp10處理RAW264.7細(xì)胞48h后,