白藜蘆醇對(duì)Pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 SLE是一種累及全身多系統(tǒng)器官組織的自身免疫性疾病，血清中存在以抗核抗體、抗dsDNA抗體為代表的多種自身抗體。腎臟是最常受累的器官。CD4+T細(xì)胞異?；罨掷m(xù)刺激B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，致病性抗體通過Ⅱ型免疫反應(yīng)引起組織器官損傷和血循環(huán)中抗原抗體復(fù)合物在組織器官沉積或原位形成的抗原抗體復(fù)合物激活補(bǔ)體，引起細(xì)胞浸潤、凝血因子活化和炎癥介質(zhì)釋放損傷組織器官是導(dǎo)致SLE發(fā)病的重要機(jī)制。目前治療SLE主要使用免疫抑

2、制劑如糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢素、嗎替考酚酯等，使SLE患者的預(yù)后有了很大改觀，但是它們對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的抑制缺乏選擇性和特異性，長期應(yīng)用存在較多毒副作用包括降低機(jī)體抵抗力誘發(fā)感染、影響生殖系統(tǒng)功能、抑制骨髓造血功能、增加腫瘤發(fā)生率等：近年來人們對(duì)生物制劑治療SLE作了大量研究，抗CD20單抗已被用于治SLE但其價(jià)格昂貴，其遠(yuǎn)期收益與風(fēng)險(xiǎn)仍難以評(píng)價(jià)；此外還有相當(dāng)部分SLE患者對(duì)這些藥物療效差，SLE仍然嚴(yán)重危害著人類健康，因此

3、研究更安全有效治療SLE新方法甚為重要。
　　 白藜蘆醇（3,5,4-三羥基苯二烯）廣泛存在于植物和水果中，由于發(fā)現(xiàn)它具有心血管保護(hù)作用而受到人們重視。大量研究表明它具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、基因沉默和免疫調(diào)節(jié)作用。白藜蘆醇是Sirt1（依賴NAD的去乙酰化酶）特異性激動(dòng)劑，基因Sirt1-/-敲除鼠會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性自身免疫狀態(tài)，血清中出現(xiàn)高滴度抗核抗體，腎臟中出現(xiàn)免疫球蛋白IgG沉積，表現(xiàn)為免疫復(fù)合物性腎炎，與SLE表現(xiàn)類似。動(dòng)物

4、實(shí)驗(yàn)顯示白藜蘆醇能減輕膠原誘導(dǎo)DBA1鼠關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、右旋聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎病情。它抑制人和小鼠T細(xì)胞活化和增殖，抑制B細(xì)胞活化增殖和抗體產(chǎn)生；抑制免疫細(xì)胞共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCI和Ⅱ類分子表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞因子如IL-2、IL-6、IL-17、INF-γ和TNF-α等產(chǎn)生，抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)。白藜蘆醇的這些作用顯示其可能具有潛在的治療SLE的功效。但至今尚無有關(guān)

5、白藜蘆醇對(duì)SLE和狼瘡模型作用的研究報(bào)道。本研究目的是了解白藜蘆醇對(duì)Pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠是否具有預(yù)防保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1．建立pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠模型。方法是將BALB/c鼠（SPF級(jí)，雌性，9-10周齡）隨機(jī)分成二組：(1)誘導(dǎo)組；一次性給BALB/c鼠腹腔注射Pristane0.5ml;(2)正常對(duì)照組：一次性給BALB/c鼠腹腔注射生理鹽水0.5ml。觀察時(shí)間為7月。觀察項(xiàng)目包括小鼠一般情

6、況、尿蛋白、血清自身抗體（抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體、抗ssDNA抗體）、腎臟病理變化和免疫球蛋白在腎小球沉積情況等。比較誘導(dǎo)組和對(duì)照組之間上述項(xiàng)目變化。
　　 2．觀察白藜蘆醇對(duì)Pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠是否具有預(yù)防作用。方法是將BALB/c鼠（SPF級(jí)，雌性，9-10周齡）隨機(jī)分為三組：(1)白藜蘆醇A組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml，次日起灌服白藜蘆醇50mg/kg/d。(2)：白藜蘆醇

7、B組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml，次日起灌服白藜蘆醇75mg/kg/d。(3)：模型對(duì)照組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml。觀察時(shí)間為7月。觀察項(xiàng)目包括小鼠一般情況、尿蛋白、血清自身抗體（抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體），腎臟病理和免疫球蛋白在腎小球沉積變化等。比較各組之間上述項(xiàng)目變化。
　　 3．體外實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對(duì)狼瘡鼠CD4+T淋巴細(xì)胞功能的影響。(1)無菌分離Pristan

8、e誘導(dǎo)狼瘡鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞。脾臟單個(gè)核細(xì)胞與不同濃度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的白藜蘆醇共同孵育30分鐘后，分別采用刀豆蛋白A、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體活化繼續(xù)培養(yǎng)，6-12小時(shí)后收集細(xì)胞利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞CD69的表達(dá)；培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞檢測(cè)CD4+T細(xì)胞CD71的表達(dá)。(2)利用磁珠分選法從脾臟單個(gè)核細(xì)胞中分離CD4+T淋巴細(xì)胞，加入不同濃度梯度(10μM

9、、20μM、40μM、80μM)的白藜蘆醇后繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)后，用AnnexinV/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡。(3)新鮮分離的脾臟單個(gè)核細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞分別進(jìn)行CFSE染色后加入不同濃度梯度（10μM、20μM、40μM、80μM）的白藜蘆醇共同孵育30分鐘，再進(jìn)行刺激培養(yǎng)4天（單個(gè)核細(xì)胞和刀豆蛋白A共培養(yǎng)，CD4+T細(xì)胞和重組小鼠IL-2、抗CD3、抗CD28抗體共培養(yǎng)），最后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖

10、情況。(4)新鮮分離的脾臟單個(gè)核細(xì)胞與不同濃度梯度（20μM、40μM、80μM）的白藜蘆醇共同孵育2小時(shí)后，與PMA、Iono共培養(yǎng)，利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2、Th17。
　　 結(jié)果：
　　 1．誘導(dǎo)組BALB/c鼠出現(xiàn)紅斑(5/10)、尿蛋白(8/10)，血清抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。光鏡下發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組小鼠部分腎小

11、球出現(xiàn)炎癥變化；免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)腎小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積；正常對(duì)照組小鼠腎小球無上述變化。這些結(jié)果提示Pristane可誘導(dǎo)BALB/c鼠發(fā)生狼瘡。
　　 2．模型對(duì)照組鼠出現(xiàn)紅斑(5/10)、尿蛋白(8/10)；腎臟病理光鏡下部分腎小球出現(xiàn)炎癥；免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)腎小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積。白藜蘆醇A組鼠未出現(xiàn)紅斑，尿蛋白(4/10)較對(duì)照組鼠減輕，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異(P＜0.05)。白藜蘆醇

12、A組鼠腎小球出現(xiàn)炎癥、細(xì)胞增生程度和腎小球免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積程度比模型對(duì)照組鼠輕。白藜蘆醇B組鼠病情變化與白藜蘆醇A組類似，和模型對(duì)照組比較上述指標(biāo)明顯減輕，有顯著性差異。但白藜蘆醇B組和白藜蘆醇A組之間比較上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示白藜蘆醇對(duì)Pristane誘導(dǎo)狼瘡鼠具有預(yù)防保護(hù)作用。但白藜蘆醇A組和白藜蘆醇B組血清抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體、血清IFN-α水平較雖比模型對(duì)照組下降，但無

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3．體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ConA、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體刺激均可使狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD69、CD71明顯增強(qiáng)。白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由抗CD3抗體活化引起的CD4+T淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)(P＜0.05)。白藜蘆醇(濃度20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由ConA、抗CD3/CD28抗體活化引起的CD4+T淋巴細(xì)胞CD69表達(dá)(P＜0.05)

14、，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，其抑制作用呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 ConA、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體刺激均可使狼瘡鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD71明顯增強(qiáng)。白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由ConA活化引起的CD4+T淋巴細(xì)胞CD71表達(dá)(P＜0.05)。白藜蘆醇(濃度20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制分別由抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體活化引起的CD4+T淋巴

15、細(xì)胞CD71表達(dá)(P＜0.05)，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，其抑制作用呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 4.白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均具有誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡的作用，并且隨著濃度增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 5．白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)能顯著抑制脾單個(gè)核細(xì)胞增殖，白藜蘆醇（濃度20μM、40μM、80μM）可顯著抑制C

16、D4+T淋巴細(xì)胞，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，對(duì)兩者增殖抑制作用呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 6.20μM、40μM、80μM白藜蘆醇均可抑制CD4+T細(xì)胞向Th1分化，隨著白藜蘆醇濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，Th1及Th1/Th2比值呈下降趨勢(shì)(P＜0.05)。白藜蘆醇對(duì)Th2和Th17作用經(jīng)檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 Pristane可誘導(dǎo)BALB/c鼠發(fā)生狼瘡，白藜蘆醇對(duì)Pr