白藜蘆醇對Pristane誘導狼瘡鼠作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 SLE是一種累及全身多系統(tǒng)器官組織的自身免疫性疾病，血清中存在以抗核抗體、抗dsDNA抗體為代表的多種自身抗體。腎臟是最常受累的器官。CD4+T細胞異?；罨掷m(xù)刺激B細胞產生自身抗體，致病性抗體通過Ⅱ型免疫反應引起組織器官損傷和血循環(huán)中抗原抗體復合物在組織器官沉積或原位形成的抗原抗體復合物激活補體，引起細胞浸潤、凝血因子活化和炎癥介質釋放損傷組織器官是導致SLE發(fā)病的重要機制。目前治療SLE主要使用免疫抑

2、制劑如糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢素、嗎替考酚酯等，使SLE患者的預后有了很大改觀，但是它們對機體免疫反應的抑制缺乏選擇性和特異性，長期應用存在較多毒副作用包括降低機體抵抗力誘發(fā)感染、影響生殖系統(tǒng)功能、抑制骨髓造血功能、增加腫瘤發(fā)生率等：近年來人們對生物制劑治療SLE作了大量研究，抗CD20單抗已被用于治SLE但其價格昂貴，其遠期收益與風險仍難以評價；此外還有相當部分SLE患者對這些藥物療效差，SLE仍然嚴重危害著人類健康，因此

3、研究更安全有效治療SLE新方法甚為重要。
　　 白藜蘆醇（3,5,4-三羥基苯二烯）廣泛存在于植物和水果中，由于發(fā)現(xiàn)它具有心血管保護作用而受到人們重視。大量研究表明它具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、基因沉默和免疫調節(jié)作用。白藜蘆醇是Sirt1（依賴NAD的去乙?；福┨禺愋约觿?，基因Sirt1-/-敲除鼠會出現(xiàn)自發(fā)性自身免疫狀態(tài)，血清中出現(xiàn)高滴度抗核抗體，腎臟中出現(xiàn)免疫球蛋白IgG沉積，表現(xiàn)為免疫復合物性腎炎，與SLE表現(xiàn)類似。動物

4、實驗顯示白藜蘆醇能減輕膠原誘導DBA1鼠關節(jié)炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、右旋聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎病情。它抑制人和小鼠T細胞活化和增殖，抑制B細胞活化增殖和抗體產生；抑制免疫細胞共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCI和Ⅱ類分子表達，誘導淋巴細胞凋亡，抑制細胞因子如IL-2、IL-6、IL-17、INF-γ和TNF-α等產生，抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)。白藜蘆醇的這些作用顯示其可能具有潛在的治療SLE的功效。但至今尚無有關

5、白藜蘆醇對SLE和狼瘡模型作用的研究報道。本研究目的是了解白藜蘆醇對Pristane誘導狼瘡鼠是否具有預防保護作用。
　　 方法：
　　 1．建立pristane誘導狼瘡鼠模型。方法是將BALB/c鼠（SPF級，雌性，9-10周齡）隨機分成二組：(1)誘導組；一次性給BALB/c鼠腹腔注射Pristane0.5ml;(2)正常對照組：一次性給BALB/c鼠腹腔注射生理鹽水0.5ml。觀察時間為7月。觀察項目包括小鼠一般情

6、況、尿蛋白、血清自身抗體（抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體、抗ssDNA抗體）、腎臟病理變化和免疫球蛋白在腎小球沉積情況等。比較誘導組和對照組之間上述項目變化。
　　 2．觀察白藜蘆醇對Pristane誘導狼瘡鼠是否具有預防作用。方法是將BALB/c鼠（SPF級，雌性，9-10周齡）隨機分為三組：(1)白藜蘆醇A組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml，次日起灌服白藜蘆醇50mg/kg/d。(2)：白藜蘆醇

7、B組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml，次日起灌服白藜蘆醇75mg/kg/d。(3)：模型對照組：均一次性腹腔注射Pristane0.5ml。觀察時間為7月。觀察項目包括小鼠一般情況、尿蛋白、血清自身抗體（抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體），腎臟病理和免疫球蛋白在腎小球沉積變化等。比較各組之間上述項目變化。
　　 3．體外實驗研究白藜蘆醇對狼瘡鼠CD4+T淋巴細胞功能的影響。(1)無菌分離Pristan

8、e誘導狼瘡鼠脾臟單個核細胞。脾臟單個核細胞與不同濃度梯度(10μM、20μM、40μM、80μM)的白藜蘆醇共同孵育30分鐘后，分別采用刀豆蛋白A、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體活化繼續(xù)培養(yǎng)，6-12小時后收集細胞利用熒光標記的單克隆抗體染色結合流式細胞術檢測CD4+T細胞CD69的表達；培養(yǎng)36小時后收集細胞檢測CD4+T細胞CD71的表達。(2)利用磁珠分選法從脾臟單個核細胞中分離CD4+T淋巴細胞，加入不同濃度梯度(10μM

9、、20μM、40μM、80μM)的白藜蘆醇后繼續(xù)培養(yǎng)36小時后，用AnnexinV/PI雙染色法結合流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞凋亡。(3)新鮮分離的脾臟單個核細胞、CD4+T淋巴細胞分別進行CFSE染色后加入不同濃度梯度（10μM、20μM、40μM、80μM）的白藜蘆醇共同孵育30分鐘，再進行刺激培養(yǎng)4天（單個核細胞和刀豆蛋白A共培養(yǎng)，CD4+T細胞和重組小鼠IL-2、抗CD3、抗CD28抗體共培養(yǎng)），最后流式細胞術檢測細胞增殖

10、情況。(4)新鮮分離的脾臟單個核細胞與不同濃度梯度（20μM、40μM、80μM）的白藜蘆醇共同孵育2小時后，與PMA、Iono共培養(yǎng)，利用熒光標記的單克隆抗體染色結合流式細胞術檢測Th1、Th2、Th17。
　　 結果：
　　 1．誘導組BALB/c鼠出現(xiàn)紅斑(5/10)、尿蛋白(8/10)，血清抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。光鏡下發(fā)現(xiàn)誘導組小鼠部分腎小

11、球出現(xiàn)炎癥變化；免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)腎小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積；正常對照組小鼠腎小球無上述變化。這些結果提示Pristane可誘導BALB/c鼠發(fā)生狼瘡。
　　 2．模型對照組鼠出現(xiàn)紅斑(5/10)、尿蛋白(8/10)；腎臟病理光鏡下部分腎小球出現(xiàn)炎癥；免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)腎小球有免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積。白藜蘆醇A組鼠未出現(xiàn)紅斑，尿蛋白(4/10)較對照組鼠減輕，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異(P＜0.05)。白藜蘆醇

12、A組鼠腎小球出現(xiàn)炎癥、細胞增生程度和腎小球免疫球蛋白(IgG、IgM)沉積程度比模型對照組鼠輕。白藜蘆醇B組鼠病情變化與白藜蘆醇A組類似，和模型對照組比較上述指標明顯減輕，有顯著性差異。但白藜蘆醇B組和白藜蘆醇A組之間比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義。上述結果提示白藜蘆醇對Pristane誘導狼瘡鼠具有預防保護作用。但白藜蘆醇A組和白藜蘆醇B組血清抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗RNP/Sm抗體、血清IFN-α水平較雖比模型對照組下降，但無

13、統(tǒng)計學意義。
　　 3．體外實驗結果顯示ConA、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體刺激均可使狼瘡鼠CD4+T細胞表達CD69、CD71明顯增強。白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由抗CD3抗體活化引起的CD4+T淋巴細胞CD69表達(P＜0.05)。白藜蘆醇(濃度20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由ConA、抗CD3/CD28抗體活化引起的CD4+T淋巴細胞CD69表達(P＜0.05)

14、，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，其抑制作用呈現(xiàn)出增強趨勢(P＜0.05)。
　　 ConA、抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體刺激均可使狼瘡鼠CD4+T細胞表達CD71明顯增強。白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制由ConA活化引起的CD4+T淋巴細胞CD71表達(P＜0.05)。白藜蘆醇(濃度20μM、40μM、80μM)均可顯著抑制分別由抗CD3抗體、抗CD3/CD28抗體活化引起的CD4+T淋巴

15、細胞CD71表達(P＜0.05)，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，其抑制作用呈現(xiàn)出增強趨勢(P＜0.05)。
　　 4.白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)均具有誘導CD4+T淋巴細胞凋亡的作用，并且隨著濃度增加，誘導細胞凋亡作用呈現(xiàn)出增強趨勢(P＜0.05)。
　　 5．白藜蘆醇(濃度10μM、20μM、40μM、80μM)能顯著抑制脾單個核細胞增殖，白藜蘆醇（濃度20μM、40μM、80μM）可顯著抑制C

16、D4+T淋巴細胞，并且隨著白藜蘆醇濃度增加，對兩者增殖抑制作用呈現(xiàn)出增強趨勢(P＜0.05)。
　　 6.20μM、40μM、80μM白藜蘆醇均可抑制CD4+T細胞向Th1分化，隨著白藜蘆醇濃度增加，抑制作用增強，Th1及Th1/Th2比值呈下降趨勢(P＜0.05)。白藜蘆醇對Th2和Th17作用經(jīng)檢驗無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 Pristane可誘導BALB/c鼠發(fā)生狼瘡，白藜蘆醇對Pr