內毒素結合蛋白CRISPLD2在膿毒癥中的表達及其意義.pdf

1、膿毒癥是危重癥患者常見并發(fā)癥，其病理生理過程復雜，牽涉全身各個器官。盡管各類廣譜抗生素的應用，新的治療方法不斷出現，膿毒癥患者死亡率依然居高不下，是困擾急診和重癥醫(yī)學醫(yī)生的重大難題。重組活化蛋白C(drotrecoginalfa.arecombinantactivatedproteinC)以及eritorantetrasodium(anovelanti-Toll-likereceptor(TLR)-4compound)雖然在1期和2期臨

2、床試驗證實有效，最近的3期臨床實驗中未發(fā)現明確的治療效果，重要的原因就是缺少合適的標志物分層，判斷哪些患者受益于治療。因此，尋找合適的生物標志物對于診斷和治療膿毒癥非常重要。
　　 導師組王志勤教授等前期工作發(fā)現半胱氨酸富集的分泌蛋白含有兩個LCCL結構域(CRISPLD2/Crispld2)，亦是內毒素結合蛋白，具有很好的結合內毒素的親和力。內毒素同CRISPLD2的親和力同CD14、MD2近似，高于TLR4，低于LBP。體內

3、發(fā)現內毒素刺激外周單個核細胞能夠促進CRISPLD2的分泌，動物實驗提示內毒素腹腔注射后24小時內CRISDPLD2蛋白水平下降，24小時后迅速反彈，5-7天到達高峰，隨后緩慢下降，維持2周左右。而重組CRISPLD2蛋白抑制內毒素同靶細胞結合，減輕炎癥反應，降低TNF-a和IL-6的水平，保護內毒素休克小鼠。人血清(漿)CRISPLD2水平高于LBP，solubleCD14等。值得注意的是嬰兒臍帶血CRISPLD2水平明顯低于成年人。

4、總之，CRISPLD2在膿毒癥病理生理過程中起著重要作用。以往的研究使用LPS誘導的內毒素休克模型，并沒有反映真正的多種細菌感染的臨床狀態(tài)，盲腸結扎穿孔(CLP)膿毒癥模型已被廣泛用于實驗性研究，并且被認為是模仿人類多種細菌感染造成的膿毒癥一個可靠的模型。盲腸結扎的范圍、穿刺針孔大小及穿刺次數等可以制作不同程度的膿毒癥，死亡率亦有很大差別。最近發(fā)現CRISPLD的R3H結構域，可以與寡核苷酸綁定在一起，已有實驗證明CpG寡核苷酸(ssC

5、pGDNA)可以使實驗動物免于細菌感染。我們研究發(fā)現，CRISPLD2包含一個RAAIH(R3H)結構，目前還沒有資料表明CRISPLD2是否結合單鏈DNA。糖皮質激素(Glucocorticoid)受體可以和CRISPLD2基因啟動區(qū)特定DNA序列(GRE)結合。
　　 基于上述背景，我們提出以下假設：CRISPLD2也是一個ssDNA結合蛋白，多種微生物抗原促進CRISPLD2分泌；上調血清CRISPLD2水平保護膿毒癥老鼠

6、(CLP)；糖皮質激素調控CRISPLD2表達，可能與糖皮質激素保護膿毒癥的作用機制相關；CRISPLD2可能成為臨床膿毒癥患者新的生物標志物。
　　 本研究的第一部分，我們證實CRISPLD2不僅是一個內毒素結合蛋白亦是一個單鏈DNA結合蛋白，多種微生物抗原如ssCPG-DNA、PGN、ssGPC-DNA和雙鏈RNA
　　 (PolyI：C)等可以刺激外周單個核細胞分泌CRISPLD2；CRISPLD2與內毒素結合抑制

7、后者同靶細胞結合，而其與單鏈DNA的結合并不阻斷后者與靶細胞結合。
　　 本研究的第二部分，我們利用膿毒癥盲腸結扎穿孔動物模型探討CRISPLD2在膿毒癥中的表達規(guī)律及以其為靶點治療膿毒癥的可行性。膿毒癥大鼠急性期的高死亡率同過度的炎癥反應以及CRISPLD2的未能及時上調相關。預注射內毒素可以上調CRISPLD2水平，同降低膿毒癥小鼠的死亡率相關。重組CRISPLD2蛋白的靜脈注射上調血清CRISPLD2水平，降低膿毒癥死亡率

8、。糖皮質激素上調正常大鼠CRISPLD2水平，小劑量糖皮質激素上調膿毒癥大鼠CRISPLD2水平同降低膿毒癥大鼠死亡率相關，中到大劑量糖皮質激素未能提高血清CRISPLD2水平，未能降低膿毒癥大鼠死亡率。
　　 本研究的第三部分，我們首先檢測CRISPLD2的表達情況，正常水平為221.39±61.50ug/ml，在膿毒癥時其水平明顯上升，而在感染性休克時其水平上升受到限制，顯著低于正常水平及膿毒癥患者水平。在膿毒癥患者中，CR

9、ISPLD2水平同病情程度評分APACHEII及SOFA明顯相關，同炎癥指標PCT相關。
　　 綜上所述：CRISPLD2不僅是一個內毒素結合蛋白，亦是一個ssCPG-DNA結合蛋白；在膿毒癥大鼠CLP模型中，嚴重的感染伴隨低水平CRISPLD2與高死亡率相關；通過腹腔預注射內毒素或者靜脈注射重組CRISPLD2，提高血清CRISPLD2水平，與降低膿毒癥小鼠死亡率相關；糖皮質激素調控大鼠CRISPLD2水平，小劑量激素促進CR