人胃癌MTHFR、表觀遺傳修飾與mTOR通路關(guān)系研究.pdf

1、上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文人胃癌MTHFR、表觀遺傳修飾與mT通路關(guān)系研究姓名：孫丹鳳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化內(nèi)科）指導(dǎo)教師：房靜遠(yuǎn)陳縈晅20080401上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士論文中文摘要織中該通路蛋白的表達(dá)情況，為發(fā)現(xiàn)胃癌分子治療新靶點提供實驗和理論依據(jù)。方法：構(gòu)建反義MTHFR質(zhì)?；騭iRNA表達(dá)質(zhì)粒以降低相應(yīng)蛋白的表達(dá)，同時構(gòu)建和轉(zhuǎn)染野生型MTHFR質(zhì)粒分析其高表達(dá)對胃癌細(xì)胞生存活力的影響。以Westernblottin

2、g鑒定該蛋白的表達(dá)，四唑藍(lán)(MTT)及細(xì)胞計數(shù)測定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期變化。實時定量PCR檢測癌基因cmyc和抑癌基因p21wAFl及M紀(jì)劇轉(zhuǎn)錄水平。甲基化特異性PCR(MSP)分析腫瘤相關(guān)基因啟動子甲基化情況。單獨或不同組合聯(lián)合應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素(RAPA)、LY294002(P13K抑制劑)、trichostatinA(TSA，組蛋白去乙?；敢种苿?以及5脫氧雜氮胞(5azadC，DNA甲基化酶1抑制

3、劑)干預(yù)胃癌MKN45及SGC7901細(xì)胞。應(yīng)用小于擾RNA(siRNA)技術(shù)敲除腫瘤細(xì)胞中的mTOR蛋白。Westemblotting檢測mTOR信號通路蛋白的表達(dá)，四唑藍(lán)(MTT)及細(xì)胞計數(shù)測定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期變化。實時定量PCR檢測抑癌基因p21wAFl、Syk(spleentyrosinekinase)、PTEN及p27砌p1轉(zhuǎn)錄水平。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測p21wAFl基因啟動子組蛋白乙酰化水平，亞硫