姜黃素和曲古菌素A調(diào)節(jié)Raji、NB4細(xì)胞表觀遺傳修飾作用的研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指非基因序列改變所致可遺傳的基因表達(dá)水平的變化。表觀遺傳修飾是基因表達(dá)的主要修飾方式，包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和RNA干擾等。正常體細(xì)胞中啟動子和5'調(diào)節(jié)區(qū)附近的胞嘧啶-鳥嘌呤二磷酸核甘(CpG)島通常是未甲基化的，而在腫瘤轉(zhuǎn)化期間，常染色體基因發(fā)生CpG島廣泛甲基化，并導(dǎo)致基因沉默。組蛋白高乙酰化使染色質(zhì)呈開放狀態(tài)，是轉(zhuǎn)錄活化所必需的。一般說來，染色質(zhì)高乙?；瘏^(qū)域是轉(zhuǎn)錄活躍的，而低乙?；瘏^(qū)域

2、則是沉默的。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上，表觀遺傳起到極為重要的作用，組蛋白高乙?；虳NA低甲基化可促進(jìn)基因表達(dá)，而組蛋白去乙?；虳NA高甲基化可抑制基因表達(dá)。組蛋白乙?；?、DNA甲基化和RNA干擾這三種分子機(jī)制互相協(xié)調(diào)，實現(xiàn)對基因表達(dá)的精確調(diào)控。近幾年研究表明，表觀遺傳改變在腫瘤發(fā)生中扮演一個重要角色，腫瘤發(fā)生的主要表觀遺傳改變是抑制腫瘤生長的基因發(fā)生DNA過甲基化和染色質(zhì)中的組蛋白去乙?；揎?。并發(fā)現(xiàn)，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和去乙酰化酶抑制劑可以抑

3、制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化和凋亡。本文研究姜黃素和曲古菌素A(TSA)對惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞NB4去乙酰化酶的作用，以及對組蛋白H3和非組蛋白P53的乙酰化水平調(diào)節(jié)，與細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑P21啟動子位點(diǎn)相關(guān)基因乙酰化作用間的相關(guān)性，探討姜黃素和TSA的表觀遺傳修飾作用與抗惡性血液病的機(jī)制。 第一部分:姜黃素和TSA誘導(dǎo)Raji、NB4細(xì)胞蛋白質(zhì)乙?；饔玫膶Ρ妊芯?背景和目的:姜黃素是中

4、藥姜黃的有效活性成分，是近年發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤新藥，在體內(nèi)外有明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。在以前研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制HL-60細(xì)胞周期素cyclinD3表達(dá)和周期阻滯。但姜黃素和TSA對Raji、NB4細(xì)胞蛋白質(zhì)乙?；饔门c其增殖關(guān)系的研究較少。本文研究姜黃素和TSA對Raji、NB4細(xì)胞去乙酰化酶HDAC1的作用和組蛋白H3、非組蛋白P53的乙?；饔茫接懕碛^遺傳修飾作用與姜黃素和TSA抗腫瘤細(xì)胞增殖作用的相關(guān)性。 方法:取生

5、長良好的Raji、NB4細(xì)胞，分別用50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，6.25μmol/L，3.125μmol/L姜黃素作用24h和36h，48h，以及300noml/L、150noml/L、75noml/L、37.5noml/L、18.75noml/L的TSA作用24h、36、48h，MTT法測定姜黃素和TSA的抗增殖作用，westernblot實驗測定HDAC1表達(dá)變化和組蛋白H3、非組蛋白P53的乙酰化水平

6、變化。 結(jié)果:(1)姜黃素以時間和濃度依賴方式抑制NB4、Raji細(xì)胞增殖。在24h、36h和48h的姜黃素抑制NB4細(xì)胞增殖的IC50值分別約為40μmol/L、25μmol/L和18μmol/L，對Raji細(xì)胞IC50值分別為35μmol/L、25μmol/L和20μmol/L。(2)曲古菌素A和姜黃素一樣對NB4、Raji細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。隨著濃度增加和時間延長，TSA對NB4、Raji細(xì)胞增殖抑制作用

7、明顯增強(qiáng)，在24h、36h和48h的對NB4細(xì)胞IC50值分別約為150nmol/L、100nmol/L和80nmol/L，對Raji細(xì)胞IC50值分別約為150μmol/L、90nmol/L和75nmol/L。(3)姜黃素明顯抑制NB4、Raji細(xì)胞HDACl的活性，在濃度為25μmol/L時，4h后HDAC1開始下降，12h明顯降低，持續(xù)48h；不同濃度姜黃素作用24h，在3.125μmol/L的濃度時HDAC1水平未見明顯減低，在

8、6.25μmol/L時可引起HDAC1水平降低，但在25～50μmol/L時HDAC1降低水平未見明顯區(qū)別；(4)姜黃素在25μmol/L作用NB4、Raji細(xì)胞10h，和空白對照組相比組蛋白H3的乙酰化水平升高，分別增加了2.4和2.3倍；TSA作用組H3乙?；淖兏黠@，分別增加了5.1倍和4.8倍；(5)姜黃素25μmol/L作用NB4細(xì)胞24h，P53蛋白水平明顯增加，同時，乙酰化P53的水平也是明顯上升的，增加了16.5倍；在

9、Raji細(xì)胞25μmol幾姜黃素作用24h，P53的表達(dá)水平降低，而乙酰化P53未檢測出。TSA明顯能調(diào)節(jié)P53的乙酰化水平，上升了42.5倍。 結(jié)論:姜黃素在抑制NB4、Raji細(xì)胞HDAC1活性的同時，上調(diào)組蛋白H3的乙?；剑瑫r對兩個細(xì)胞系的增殖均有抑制作用，說明姜黃素的抗白血病細(xì)胞和淋2巴瘤細(xì)胞增殖作用與姜黃素調(diào)節(jié)乙酰化活性有關(guān)。但是，在NB4細(xì)胞和Raji細(xì)胞系，P53蛋白的表現(xiàn)相反，原因在于Raji細(xì)胞存在P53

10、基因突變，而NB4細(xì)胞是野生型的，姜黃素對NB4細(xì)胞的抑制作用可能與P53的乙?；嘘P(guān)，而在Raji細(xì)胞可能有其它機(jī)制。姜黃素和TSA可能通過表觀遺傳修飾作用抑制惡性血液病細(xì)胞增殖。 第二部分:姜黃素調(diào)控Raji細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究 背景和目的:姜黃素通過抑制cyclinD3表達(dá)抑制白血病細(xì)胞增殖和誘發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期素(cyclin)-細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)-細(xì)胞周期依賴性激酶抑制

11、劑(CDKI)的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，P21WAF1/CIP1是一種廣譜的CDKI，對細(xì)胞周期起著重要作用，表達(dá)水平升高可以阻滯細(xì)胞于G1期。本文研究姜黃素在Raji細(xì)胞周期中對P21和細(xì)胞周期的作用。 方法:取生長良好的Raji細(xì)胞，分別用50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，6.25μmol/L，3.125μmol/L姜黃素作用4h、8h、12h、24h、48h，RT-PCR檢測P21mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，w

12、esternblot測定姜黃素作用后P21的蛋白表達(dá)情況以及流式細(xì)胞儀測定姜黃素作用后Raji細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:姜黃素以劑量和時間依賴方式促進(jìn)P21WAF1/CIP1表達(dá)。(1)在25μmol/L時，8h已見到P21WAF1/CIP1mRNA上升，水平穩(wěn)定表達(dá)24h。在姜黃素濃度大于6.25μM時，24小時可測到P21WAF1/CIP1mRNA表達(dá)。(2)8h時已測到P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)，12h時蛋

13、白表達(dá)已明顯升高，24h表達(dá)水平最高，持續(xù)48h；當(dāng)姜黃素濃度大于6.25μmol/L作用24h時可見P21WAF1/CIP1明顯升高。(3)12.5μmol/L姜黃素作用24小時，Raji細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期阻止，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增加，大部分細(xì)胞受阻于G2/M期，在36h抑制作用更加明顯，主要積聚在G0/G1期。(4)姜黃素可以誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，在24h時，6.25μmol/L時凋亡率為(5.15±0.70)％增加到

14、50μmol/L(42.72±3.65)％；在25μmol/L姜黃素作用不同時間時，凋亡率明顯有時間依賴性，在24h為(14.58±1.55)％，36h為(30.21±8.37)％，48h為(45.08±11.13)％，隨作用時間增加，凋亡率明顯增加。 結(jié)論:姜黃素以時間和劑量效應(yīng)誘導(dǎo)了Raji細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑P21WAF1/CIP1的表達(dá)和阻滯Raji細(xì)胞的周期進(jìn)程，同時也誘導(dǎo)了Raji細(xì)胞的凋亡。說明姜黃素誘導(dǎo)Raj

15、i細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制可能是細(xì)胞周期阻滯，也許與姜黃素調(diào)節(jié)微管蛋白的乙酰化作用有關(guān)。 第三部分:姜黃素和TSA對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因P21表達(dá)的表觀遺傳修飾作用 背景和目的:表觀遺傳修飾對基因的調(diào)控起重要作用，包括組蛋白乙?；?、DNA甲基化和RNA干擾等，組蛋白高乙?；虳NA低甲基化促進(jìn)基因表達(dá)，而組蛋白去乙?；虳NA高甲基化抑制基因表達(dá)，這幾種表觀遺傳修飾方式互相協(xié)調(diào)，實現(xiàn)基因表達(dá)的精確調(diào)控。表觀遺傳修飾異常與惡性血液病

16、的發(fā)生密切相關(guān)。本部分研究姜黃素和TSA對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因P21表達(dá)的表觀遺傳修飾作用。 方法:取生長良好的Raji細(xì)胞培養(yǎng)12h，分別用25μmol/L姜黃素和150nmol/L的TSA處理10h。染色質(zhì)免疫沉淀分析P21啟動子位點(diǎn)相關(guān)基因組蛋白的乙?；?，同時RT-PCR檢測P21mRNA表達(dá)變化。 結(jié)果:(1)染色體免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，姜黃素和TSA免疫沉淀組DNA擴(kuò)增后，其DNA產(chǎn)量分析顯示與未加藥對照組相比增加

17、1.9和3.5倍，證明在Raji細(xì)胞P21WAF1/CIP1啟動子基因位點(diǎn)乙酰化組蛋白H3水平分別增加了1.9和3.5倍，說明姜黃素和TSA可以調(diào)節(jié)Raji細(xì)胞P21WAF1/CIP1啟動子基因位點(diǎn)組蛋白H3乙酰化水平。(2)RT-PCR結(jié)果分析顯示，在姜黃素影響P21WAF1/CIP1啟動子位點(diǎn)組蛋白H3乙?；酵瑫r，P21WAF1/CIP1mRNA表達(dá)也明顯上升，和陰性對照組相比，增加了1.5倍，說明姜黃素提高P21WAFI/CI