姜黃素提取物毒性及免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：
　　現(xiàn)階段，藥用植物生物活性物質(zhì)的醫(yī)學(xué)價(jià)值，逐步遭到認(rèn)可和重視，大量的學(xué)者紛紛將研究的重心，轉(zhuǎn)移到對藥用植物醫(yī)學(xué)價(jià)值的探索中。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，從很早的時(shí)候，便認(rèn)識到姜黃的醫(yī)用價(jià)值，并且明確記載姜黃具備扶正祛邪等醫(yī)療效用，在醫(yī)療實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。目前研究認(rèn)為姜黃屬植物提取物主要成分為姜黃素類和類姜黃素類化合物以及其主要化合物。此外還有糖類、類姜黃素類、多肽類、姜黃素類等化合物。同時(shí)，在姜黃素提取物里面，有一種顏色呈黃色的多酚

2、類化合物，即是姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)和雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)的混合體，大多數(shù)學(xué)者將其定義為姜黃色素類化合物。同時(shí)，在姜黃色素中，其主要的活性成份，即是姜黃素。
　　由于姜黃素的醫(yī)用價(jià)值逐步得到國內(nèi)外諸多學(xué)者的認(rèn)可和重視，從而在不斷的研究中，姜黃素所擁有的生物活性先后被開發(fā)和挖掘，目前，所知的功效主要為抗氧化清除自由基、抗腫瘤等，然而，在

3、針對其提取物免疫調(diào)節(jié)功能，以及毒理學(xué)安全性的介紹，卻十分匱乏。本課題擬通過整體動物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究姜黃素提取物毒性和免疫調(diào)節(jié)功能，為姜黃素在功能食品方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：
　　1.姜黃素提取物毒性研究
　　急性毒性試驗(yàn):為了測試姜黃素的提取物急性毒性情況，本實(shí)驗(yàn)采用限量法實(shí)施試驗(yàn)工作。其中，共選取20只小鼠，雌、雄各一半，對每只小鼠經(jīng)口給予20g/kg.bw姜黃素提取物，經(jīng)14天的觀察記錄后，結(jié)果LD5

4、0＞20 g/kg.bw，因此得出結(jié)論，姜黃素為無毒物質(zhì)。
　　遺傳毒性試驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)采用Ames試驗(yàn)平板摻入法，來測定姜黃素提取物的遺傳毒性情況，同時(shí)，為了提高實(shí)驗(yàn)的客觀性和對比性，本實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定了加S-9、不加S-9混合液等實(shí)驗(yàn)小組，劑量分別為5000、1000、200、40、8μg/皿，每個(gè)組別設(shè)3個(gè)平皿。在完成增菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)后，采用無菌小試管將融化頂層培養(yǎng)基進(jìn)行裝置。并且將頂層培養(yǎng)基2 ml，放置在45℃水浴里面進(jìn)行保溫

5、，同時(shí)先后將測試菌株新鮮增菌液0.1 ml、受試物0.1 ml注入其中，緩慢搖晃后，使其快速的與底層培養(yǎng)基進(jìn)行融合，待其均勻分布后，水平放置，直至其完全固化為止。之后，再將其放置在37℃的溫度中進(jìn)行培養(yǎng)，2天后，觀察記錄。為了提高實(shí)驗(yàn)的客觀性，再次進(jìn)行陽性對照、溶劑對照等試驗(yàn)。整套試驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行兩次。其中，試驗(yàn)結(jié)果表明，在先后的兩次試驗(yàn)中，培養(yǎng)皿中的自發(fā)揮菌落數(shù)始終保持在受試物各劑量組回變菌落數(shù)2倍的范圍內(nèi)，并且尚未出現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)

6、系，從而證實(shí)了當(dāng)受試物劑量控制在8～5000μg/皿的時(shí)候，鼠傷寒沙門氏菌四株試驗(yàn)菌株無致突變作用。
　　小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn):在實(shí)施該項(xiàng)試驗(yàn)方案時(shí)，共挑選50只SPF小鼠，25只雌鼠、25只雄鼠，隨機(jī)分成5個(gè)小組。實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，染毒劑量分別為2.5、5.0、10.0g/kg.bw，另設(shè)兩個(gè)在對照組（陰性組環(huán)磷酰胺陽性對照組）。共取三份受試物，其劑量分別為2.5、5.0、10.0g，采用植物油對其進(jìn)行配比，直至20m

7、l，并確保其終濃度依次為0.125、0.250、0.500g/ml，灌胃于實(shí)驗(yàn)動物。灌胃量為0.2ml/10g.bw，共兩次，間隔24h。得到結(jié)果如下，當(dāng)最后一次給予受試物后，小鼠于6h后麻醉處死。通過抽取死亡小鼠骨髓，進(jìn)行涂片檢驗(yàn)后，在每一只動物骨髓圖片上鏡檢至少1000PCE高達(dá)1000個(gè)。同時(shí)，有針對性的對200個(gè)PCE進(jìn)行觀察記錄，計(jì)算并確認(rèn)其NCE數(shù)目和PCE/NCE比值。由結(jié)論可知，在微核率上，陰性對照組與受試物各劑量組兩個(gè)

8、小組之間并無較大差異（P＞0.05）。
　　小鼠精子畸形試驗(yàn):SPF小鼠隨機(jī)分為5組，每組5只。并且分別設(shè)定了3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，將其染毒劑量依次設(shè)定為2.5、5.0、10.0g/kg.bw，為了提高實(shí)驗(yàn)的可比性，設(shè)定植物油陰性、環(huán)磷酰胺陽性兩個(gè)對照小組。共取三份受試物，其劑量分別為2.5、5.0、10.0g，采用植物油為溶劑對其進(jìn)行配制，直至20ml，并確保其終濃度依次為0.125、0.250、0.500g/ml，通過灌胃的方式，給予實(shí)

9、驗(yàn)動物。灌胃量為0.2ml/10g.bw，每日一次，連續(xù)5d。實(shí)驗(yàn)結(jié)論證實(shí)了，在精子畸變率上，陰性對照組與受試物各劑量組兩個(gè)小組之間，并沒有出現(xiàn)較大的差異化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，然而，其與環(huán)磷酰胺陽性組比對時(shí)，卻出現(xiàn)了極為顯現(xiàn)的差異(P＜0.01)，表明該樣品無致小鼠精子畸變作用。
　　大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn):SPF級健康大鼠共計(jì)80只，隨機(jī)分為4個(gè)小組，每組20只，雌性小鼠10只雄性小鼠10只。設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，染毒劑量分別

10、為1.5、3.0、6.0g/kg.bw（分別相當(dāng)于人體推薦量的25、50、100倍）。以植物油為溶劑將樣品分別配至所需濃度。同時(shí)設(shè)立溶劑對照組。在30天內(nèi)，對每一只動物都以1.0 ml/100g.bw/天的計(jì)量，對其實(shí)施經(jīng)口灌胃，并且在24h內(nèi)，對灌胃給予動物的行為特征、中毒程度及其死亡幾率進(jìn)行觀察記錄。每天2次對動物進(jìn)行灌胃給藥，每隔7天，對每只動物進(jìn)行稱量，并以表格的形式，記錄每周的食物利用率以及總食物支出。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢瑢γ恐粍游镞M(jìn)

11、行16h的禁食，并稱量其體重。取血位置為腹主動脈，取血完畢后，對動物實(shí)施解剖，并實(shí)時(shí)取材。血液學(xué)測定血液學(xué)測定采用K2EDTA-抗凝血。同時(shí)，除了進(jìn)行血液測定之外，還需要受試物的主要臟器進(jìn)行稱量，計(jì)算得出臟器系數(shù)。經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了在本次的試驗(yàn)期間內(nèi)，各劑量組動物都表現(xiàn)出良好的生長狀況，以及其食物利用率、體重增重程度等指標(biāo)都十分正常，在血液檢驗(yàn)中，其各項(xiàng)血液指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)。雖然在實(shí)施病理組織學(xué)檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)在高劑量組、對照組

12、兩個(gè)小組中，存在部分標(biāo)本產(chǎn)生了病變，但是其表現(xiàn)程度都十分輕微，并且無組間特異性分布，不能界定為具備毒理學(xué)意義。
　　2.姜黃素提取物對小鼠免疫功能的影響
　　在本實(shí)驗(yàn)中，所挑選的小鼠為SPF級ICR小鼠，為了提高實(shí)驗(yàn)的客觀對比性，本次共設(shè)定3個(gè)劑量組，即:0.30、0.60、1.80g/kg bw，同時(shí)設(shè)立溶劑對照組，連續(xù)30天，對小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃，其劑量為0.1 mL/10g.bw/天，并對其各項(xiàng)指標(biāo)加以檢測。針對小鼠細(xì)胞

13、免疫功能的檢測，其涉及的內(nèi)容主要為細(xì)胞免疫功能測定包括小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，針對體液免疫功能測定采用的是血清溶血素測定和抗體生成細(xì)胞檢測，單核-巨噬細(xì)胞功能測定采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，以及NK細(xì)胞活性測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力OD差值上，本次實(shí)驗(yàn)的0.30、1.80g/kg.bw劑量組與對照組兩個(gè)小組之間，表現(xiàn)出了十分顯現(xiàn)的差異特征(P＜0.05);并且，在HC50上，0.