中藥提取物免疫調(diào)節(jié)作用的研究及多糖的提取分離鑒定和分子量測(cè)定.pdf

1、畜禽疾病特別是病毒性疾病仍然是阻礙養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，疫苗是防治疾病最有效的方法。但是，近幾年由于免疫抑制性病毒的普遍存在，預(yù)防工作變得異常艱難，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于研究提高疫苗的特異性和非特異性免疫增強(qiáng)作用。中藥是我國(guó)傳統(tǒng)文化的結(jié)晶，是中華民族的文化瑰寶，在畜禽疾病的防治過(guò)程中起過(guò)重要的作用。中藥免疫增強(qiáng)劑對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能具有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)作用，可提高機(jī)體的抗病力和抵抗力，顯示了顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用。本研究以臨床上常常發(fā)

2、生的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）感染雛雞，造成一定程度的免疫抑制，建立試驗(yàn)動(dòng)物模型，比較中藥提取物對(duì)不同免疫狀態(tài)下雞的免疫調(diào)節(jié)作用，并對(duì)主要成分多糖進(jìn)行提取分離鑒定和分子量測(cè)定，為下一步多糖的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1.中藥提取物免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　 1.1中藥提取物和鹽酸左旋咪唑?qū)﹄u的免疫調(diào)節(jié)作用
　　 分別在臨床健康雞和在1日齡感染網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）誘發(fā)了免疫抑制的雞測(cè)試了中藥提取物

3、和鹽酸左旋咪唑?qū)﹄u的免疫調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)雞體重、免疫器官的影響。結(jié)果表明，在飲水中添加50ppm的鹽酸左旋咪唑，無(wú)論在健康雞還是免疫抑制雞對(duì)NDV、H5-AIV滅活疫苗免疫后的HI抗體水平、體重和免疫器官指數(shù)都沒(méi)有顯著影響（p>0.05）。由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物飼喂健康雞對(duì)NDV和H5-AIV免疫后的HI抗體水平也沒(méi)有顯著影響（p>0.05）。但是在REV誘發(fā)了免疫抑制的雞，相對(duì)于不喂中藥提取物的對(duì)照組，該中藥提取物可顯

4、著提高對(duì)NDV、H5-AIV的HI抗體水平和免疫器官指數(shù)（p＜0.01），雖然仍顯著低于未經(jīng)REV感染的對(duì)照雞。該研究表明，由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物對(duì)REV誘發(fā)的免疫抑制狀態(tài)下的雞有顯著的免疫增強(qiáng)作用，鹽酸左旋咪唑沒(méi)有免疫增強(qiáng)作用。
　　 1.2不同組合中藥提取物對(duì)雞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　 分別在臨床健康雞和在1日齡感染網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）誘發(fā)了免疫抑制的雞測(cè)試了不同濃度黃芪提取物和由黃芪、黨參、淫羊

5、藿、甘草組成的不同組合的中藥提取物對(duì)雞的體液免疫調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)雞體重、免疫器官的影響。結(jié)果表明，不同濃度的單一黃芪提取物對(duì)NDV和H5-AIV免疫后的HI抗體滴度沒(méi)有顯著影響，對(duì)雞的體重、免疫器官指數(shù)也沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草混合物組成的中藥提取物，在健康雞對(duì)NDV和H5-AIV滅活疫苗免疫后的HI抗體滴度沒(méi)有顯著影響。但是在REV誘發(fā)了免疫抑制的雞，該混合中藥提取物可顯著提高對(duì)NDV和H5-AIV的H

6、I抗體滴度（p<0.01），雖然仍顯著低于未經(jīng)REV感染的對(duì)照雞。該中藥制劑還可以顯著增加胸腺和法氏囊指數(shù)，即緩和由REV誘發(fā)的萎縮。該研究表明，單一黃芪不能提高由REV誘發(fā)的免疫抑制雞的抗體水平，黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的中藥提取物對(duì)REV誘發(fā)的免疫抑制雞具有顯著的免疫增強(qiáng)作用。
　　 1.3不同提取方法中藥提取物對(duì)雞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　 分別在臨床健康雞和1日齡感染網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）誘發(fā)了免疫抑制的

7、雞測(cè)試了經(jīng)不同提取方法獲得的中藥提取物的免疫調(diào)節(jié)作用，并研究水溶性提取物對(duì)不同來(lái)源雞的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，在飲水中添加由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物，無(wú)論是水溶性提取物（水提取物和乙醚提取后的水提取物）還是脂溶性提取物（乙醚提取物），對(duì)健康雞NDV和H5-AIV滅活疫苗免疫后HI抗體水平均無(wú)顯著影響（P>0.05），水溶性提取物對(duì)REV誘發(fā)的免疫抑制雞的NDV和H5-AIV滅活疫苗免疫后HI抗體水平有顯著影響（p<0.01）

8、，可顯著提高其抗體水平。但是，由同樣藥物組成的脂溶性提取物卻沒(méi)有免疫增強(qiáng)作用（P>0.05）。中藥提取物對(duì)健康雞和SPF來(lái)源繼續(xù)在SPF下飼養(yǎng)的雞對(duì)NDV和H5-AIV滅活疫苗免疫后的HI抗體滴度沒(méi)有顯著影響（p>0.05）。但是在REV誘發(fā)了免疫抑制的雞和SPF來(lái)源在非SPF條件下飼養(yǎng)的雞，該中藥提取物可顯著提高對(duì)NDV和H5-AIV的HI抗體滴度（p<0.01），雖然仍顯著低于未經(jīng)REV感染的對(duì)照雞。
　　 1.4不同分子量

9、段中藥提取物對(duì)雞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　 用網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）感染海藍(lán)褐公雞和SPF來(lái)源的雞誘發(fā)免疫抑制，在飲水中添加中藥提取物或不同分子量段的中藥提取物，測(cè)試其對(duì)雞的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，同樣由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物和分子量段在1-10萬(wàn)道爾頓的提取物，不論是先混合、提取再超濾、濃縮還是先分別提取、超濾再濃縮、混合可顯著提高感染REV雞的NDV和H5-AIV的HI抗體滴度（p<0.01），雖然仍顯著低于未

10、經(jīng)感染REV的對(duì)照雞。但分子量小于1萬(wàn)道爾頓和大于10萬(wàn)道爾頓的提取物，對(duì)感染REV的免疫抑制雞沒(méi)有顯著免疫增強(qiáng)作用（p>0.05）。試驗(yàn)結(jié)果還表明，中藥提取物和分子量在1-10萬(wàn)道爾頓的提取物對(duì)SPF來(lái)源的雞在非SPF環(huán)境下飼養(yǎng)有顯著的免疫增強(qiáng)作用（p<0.05），對(duì)同樣是SPF來(lái)源的雞繼續(xù)在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)卻沒(méi)有顯著的免疫增強(qiáng)作用（p>0.05）。該研究表明，由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物其免疫增強(qiáng)作用的分子量在1-10萬(wàn)道

11、爾頓之間，而對(duì)SPF來(lái)源繼續(xù)在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)的雞沒(méi)有顯著免疫增強(qiáng)作用。
　　 1.5中藥提取物對(duì)雞外周淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響
　　 為了檢測(cè)中藥提取物對(duì)外周淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響，采用中藥提取物對(duì)感染網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）雞外周血液、胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率進(jìn)行試驗(yàn)，建立MTT法來(lái)觀察淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，REV顯著抑制雛雞血液、胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（p<0.05）；中藥提取物對(duì)健康雛雞血液、胸腺和脾臟

12、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著的影響（p>0.05），可顯著提高由REV誘發(fā)的免疫抑制雞35日齡前血液、胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和21日齡前脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率（p<0.05），對(duì)49日齡后血液、胸腺和35日齡后脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率影響不明顯（p>0.05）。
　　 2.多糖的提取分離鑒定和分子量測(cè)定
　　 2.1中藥提取物化學(xué)成分初步鑒定
　　 本試驗(yàn)用中藥提取物化學(xué)成分的鑒定方法鑒定了由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的用不同方

13、法提取的混合物的成分。結(jié)果表明，用水浸提后得到的提取物含有鞣質(zhì)、多糖及其苷類、皂苷、氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，用乙醚浸提后得到的提取物含有生物堿、黃酮及其苷類、揮發(fā)油、油脂類，用乙醚浸提后再用水浸提得到的提取物和用水浸提后得到的提取物成分相同，水浸提后的提取物用超濾膜過(guò)濾后，分子量小于1萬(wàn)道爾頓的提取物含有鞣酸、氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，分子量在1-10萬(wàn)道爾頓的提取物中含有多糖及其苷類、皂苷、多肽和蛋白質(zhì)，分子量大于10萬(wàn)道爾頓的提取物含有糖

14、、多糖及其苷類、皂苷、多肽和蛋白質(zhì)。水溶性成分和脂溶性成分的區(qū)別在于水溶性成分含有糖、多糖、皂苷，而脂溶性成分沒(méi)有，證明多糖及其苷類和皂苷具有免疫增強(qiáng)作用。
　　 2.2中藥粗多糖的提取參數(shù)研究
　　 本試驗(yàn)采用四因素三水平正交設(shè)計(jì)研究了提取溫度（A），料液比（B），提取時(shí)間（C）及提取次數(shù)（D）對(duì)中藥粗多糖得率的影響。最佳提取條件參數(shù)為A3B1C3D3，即浸提溫度80℃，料液比1:10，浸提時(shí)間3h，提取次數(shù)3次。采用

15、苯酚-硫酸法測(cè)得復(fù)方中藥多糖提取物GCPS中多糖含量為48.45％，測(cè)試結(jié)果穩(wěn)定可靠。苯酚-硫酸法是目前測(cè)定多糖含量較可靠的傳統(tǒng)方法之一，本法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好。
　　 2.3中藥多糖的分離純化和分子量測(cè)定
　　 由黃芪、黨參、淫羊藿和甘草組成的復(fù)方中藥提取物，按Sevag法脫除蛋白質(zhì)后得復(fù)方粗多糖GCPS。粗多糖分別用終濃度50％、60％和70％的乙醇沉淀，離心，干燥，得到三種多糖組分（GCPS-1、GCPS

16、-2和GCPS-3）；將分級(jí)醇沉所得多糖組分分別進(jìn)行DEAE-纖維素柱層析，得三種主要多糖GCPS-1A，GCPS-2A，GCPS-3A，分別進(jìn)行TOYOPEARL HW-55F凝膠柱層析，得三種主要成分GCPS-1AⅠ，GCPS-2AⅡ，GCPS-3AⅢ。經(jīng)過(guò)Sephadex G-200凝膠柱層析、紫外可見分光光度分析和紙層析鑒定，表明是均一組分，不含有核酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)；并測(cè)得均一組份GCPS-1AⅠ中的多糖含量為77.6％，GCPS

17、-2AⅡ中的多糖含量為95.2％，GCPS-3AⅢ中的多糖含量為87.3％；根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran系列的洗脫體積得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-0.1734X+0.8676，R=0.9993，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)得GCPS-1AⅠ，GCPS-2AⅡ及GCPS-3AⅢ的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為301254、94541和12453。
　　 3.結(jié)語(yǔ)
　　 本研究首次應(yīng)用REV作為免疫抑制因素建立試驗(yàn)動(dòng)物模型，研究了由黃芪

18、、黨參、淫羊藿和甘草組成的提取物對(duì)不同免疫狀態(tài)下雛雞和SPF雞的免疫調(diào)節(jié)作用，不同分子量段提取物的免疫調(diào)節(jié)作用，不同提取方法提取物的免疫調(diào)節(jié)作用，不同組合中藥提雙物的免疫調(diào)節(jié)作用，并與鹽酸左旋咪唑進(jìn)行了比較。還進(jìn)一步研究了中藥提取物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。建立了應(yīng)用REV作為測(cè)試中藥提取物免疫增強(qiáng)作用的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，證實(shí)了復(fù)方中藥提取物的免疫增強(qiáng)作用。而且這種有效成分是水溶性的，分子量在1-10萬(wàn)道爾頓之間。但具體的化學(xué)成分還有待于進(jìn)