經(jīng)表觀遺傳修飾的EPCs治療兔早期股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分
　　背景：內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的培養(yǎng)一般都是通過誘導(dǎo)原代單個(gè)核細(xì)胞分化獲得,但其數(shù)量較少,不足以支持大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。鑒于 EPCs的分化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)難度較大,直到目前尚未建立商品化的細(xì)胞系。有效的提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化增殖是利用EPCs治療股骨頭壞死的關(guān)鍵問題。
　　目的：確立一種簡(jiǎn)便易行的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法,以滿足進(jìn)一步深入研究 EPCs的生物學(xué)功能和實(shí)現(xiàn)以 EPCs為基礎(chǔ)

2、的細(xì)胞治療的需要,從而使以 EPCs為基礎(chǔ)的再生科學(xué)不再掣肘于方法學(xué)上的瓶頸。
　　方法：從人臍帶血中采用ficoll梯度密度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,使用改良的Hill集落形成法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞。通過顯微鏡觀察培養(yǎng)得到的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,通過免疫熒光檢測(cè) EPCs攝取 DiI-Ac-LDL及共結(jié)合 FITC- UEA1的能力,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè) EPCs表面標(biāo)志 CD133/KDR和CD34/KDR的共表達(dá)情況,采用MTT法檢測(cè) MN

3、Cs分化為 EPCs后的增殖能力。
　　結(jié)果：采用改良的Hill集落形成法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞,在顯微鏡下可見典型的EPCs集落形成。免疫熒光結(jié)果顯示99.7％的細(xì)胞具有雙陽(yáng)性,由此證實(shí) EPCs培養(yǎng)成功。流失結(jié)果顯示:EPCs表面標(biāo)志 CD133/KDR和CD34/KDR的共表達(dá)率分別是52.30％±7.43％和54.77％±3.02％。 MTT結(jié)果顯示單個(gè)核細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞后細(xì)胞呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。
　　結(jié)論:EPCs表面抗原

4、表達(dá)較典型,符合早期 EPCs的特定。采用改良的Hill集落形成法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞,可以得到足夠數(shù)量的早期 EPCs,有效地提高了EPCs分化增殖能力,可以為進(jìn)一步深入研究 EPCs的生物學(xué)行為提供有力的支持。
　　第二部分
　　背景:股骨頭缺血壞死(ANFH)的病因復(fù)雜,一旦發(fā)生股骨頭缺血性壞死,股骨頭局部血管的損傷和側(cè)枝循環(huán)的難以形成必然導(dǎo)致預(yù)后較差。目前關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,普遍認(rèn)為是由體內(nèi)外源性多種環(huán)境因素所

5、引起的,如激素和飲酒等,導(dǎo)致了該病現(xiàn)在的治療方法也只是集中在如何處理其并發(fā)癥上,缺乏從根本上逆轉(zhuǎn)其病理進(jìn)展變化的治療方法。先前的臨床觀察實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確認(rèn) EPCs在 ANFH患者的功能及數(shù)量均減低。另外,研究發(fā)現(xiàn)在 EPCs血管形成的過程中,CXCR4在EPCs向缺血或損傷區(qū)域靶向遷移的過程中起重要作用。近幾年迅速發(fā)展的表觀遺傳學(xué)研究表明基因的表觀遺傳修飾是連接外界環(huán)境和基因相互作用的橋梁,因此對(duì)EPCs的CXCR4基因通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制

6、進(jìn)行相關(guān)研究,以此來解決使用EPCs治療缺血性疾病的缺點(diǎn),為從根本上逆轉(zhuǎn)骨壞死病理變化的治療方法的研究具有重要意義。
　　目的:通過 CXCR4基因 DNA去甲基化及組蛋白乙?；岣?EPCs表面 CXCR4基因表達(dá)水平。采用相關(guān)方法檢測(cè)上調(diào)的CXCR4對(duì) EPCs數(shù)量和功能的影響。為提高 EPCs治療的缺血性疾病的療效,進(jìn)而尋找從根本上逆轉(zhuǎn) ANFH的有效方法。
　　方法：淋巴細(xì)胞梯度密度離心法從人臍帶血分離單個(gè)核細(xì)胞,采

7、用10ng/ml VEGF及10ng/ml FGF-basic誘導(dǎo)培養(yǎng)一周后得到內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)并對(duì)其進(jìn)行鑒定。單獨(dú)或聯(lián)合使用不同濃度梯度 TSA和DAC對(duì) EPCs進(jìn)行干預(yù),并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光48h。采用MTT檢測(cè) EPCs的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)活性百分比,使用Western blot和實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)各組 CXCR4蛋白和mRNA表達(dá)水平。甲基化特異性 PCR檢測(cè) CXCR4基因 CpG島甲基化狀態(tài)改變。Transwell遷移

8、實(shí)驗(yàn)檢測(cè) EPCs遷移能力的變化。
　　結(jié)果: MTT結(jié)果顯示 EPCs的絕對(duì)數(shù)量程上升趨勢(shì),但是隨著藥物濃度增大和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)其上升趨勢(shì)變小,其活性百分比隨著藥物濃度增大和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。Western blot和實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示干預(yù)后 CXCR4表達(dá)水平隨著隨著藥物濃度增大而升高。MSP結(jié)果表明 CXCR4基因中CpG島的甲基化狀態(tài)在非干預(yù)狀態(tài)下是甲基化的,在使用中高濃度藥物干預(yù)時(shí)變?yōu)榘爰谆蛉ゼ谆?br

9、>　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 EPCs表面的CXCR4基因可以通過改變其表觀遺傳修飾狀態(tài)來增加其表達(dá)水平,從而提高 EPC在組織修復(fù)中的功能。EPCs的CXCR4基因的表觀遺傳干預(yù)可以作為逆轉(zhuǎn) ANFH病理進(jìn)展的一個(gè)新的思路。
　　第三部分
　　背景:股骨頭壞死(ANFH)是一種進(jìn)展性疾病,病情難以逆轉(zhuǎn),患者多數(shù)結(jié)局是行全髖置換手術(shù)。研究發(fā)現(xiàn) EPCs具有可以向成骨方向分化,通過旁分泌作用增強(qiáng)缺血組織自我修復(fù)和形成血管的能力,有

10、用于治療 ANFH的潛力。越來越多的研究表明與 ANFH有著相似環(huán)境因素的心血管疾病中,表觀遺傳修飾在動(dòng)脈狹窄和粥樣硬化病情發(fā)展過程中起著極其重要的作用。以上研究結(jié)果提示可以嘗試通過EPCs的表觀遺傳修飾來治療 ANFH。
　　目的:故本研究采用表觀遺傳修飾的辦法提高 EPCs細(xì)胞表面 CXCR4表達(dá),并將其應(yīng)用在 ANFH的動(dòng)物模型上,以檢測(cè)其治療效果。
　　方法:50只新西蘭大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后進(jìn)行骨壞死造模,適應(yīng)性喂

11、養(yǎng)期間進(jìn)行自體 EPCs富集,凍存?zhèn)溆?。骨壞死造?周后進(jìn)行 MRI檢測(cè),造模成功的新西蘭大白兔分為3組:對(duì)照組,EPCs治療組,epigenetic- EPCs治療組。分別用生理鹽水,EPCs懸液,表觀遺傳修飾過的EPCs的懸液從耳緣靜脈滴入。4周后進(jìn)行顯微CT和組織學(xué)切片檢測(cè),評(píng)價(jià)總體治療效果。
　　結(jié)果:50只新西蘭大白兔最終有36只新西蘭大白兔經(jīng) MRI檢測(cè)顯示股骨頭有異常信號(hào)改變,提示早期股骨頭壞死。成模率72％。顯微