高能震波治療早期股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、股骨頭缺血性壞死是由各種原因引起的股骨頭血液循環(huán)障礙性疾病，是骨科疑難病之一。近年來，由于外傷、大量飲酒、高凝血狀態(tài)、長期服用皮質(zhì)類固醇激素藥物等。該病發(fā)病率日漸增高。嚴重地影響著人們的健康及運動，已引起國內(nèi)外骨科學者重視，成為臨床亟待解決的重要課題。股骨頭壞死早期病程可以逆轉(zhuǎn)，演變的周期很長，進展至退行性髖關(guān)節(jié)病變晚期需3～5年。如早期不能得到及時有效的治療，就會使股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙變窄，最后導致壞死性骨關(guān)節(jié)炎，使病人髖關(guān)節(jié)功能障礙

2、而致殘。股骨頭壞死的治療方法很多，但迄今尚未有一種方法能保存股骨頭的活力。對于已經(jīng)塌陷的股骨頭更是缺乏有效的治療方法，晚期患者只能通過全髖關(guān)節(jié)置換來治療，給患者及家屬身心帶來了很大痛苦，經(jīng)濟上也產(chǎn)生沉重的負擔。因此，把研究的焦點集中在早期股骨頭壞死的治療上，尋找安全、高效、經(jīng)濟的治療方法，有著重要的臨床意義和社會效益。 本實驗首先聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)毒素和甲基強的松龍誘導兔早期股骨頭壞死動物模型，應(yīng)用不同能量強度與劑量參數(shù)的高能震波進行治

3、療，觀測其對股骨頭組織結(jié)構(gòu)，血管、骨結(jié)構(gòu)重建的影響，分析其治療股骨頭壞死的能量方式、強度與劑量的最佳參數(shù)；同時應(yīng)用免疫組化和細胞、分子生物學技術(shù)，觀測高能震波對股骨頭骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)及其基因表達的影響，探討其作用機理，為臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。 1.誘導早期股骨頭缺血性壞死的動物模型。聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)毒素和甲基強的松龍誘導兔早期股骨頭壞死，健康成年雄性新西蘭白兔耳緣靜脈內(nèi)注射大腸桿菌內(nèi)

4、毒素10μg/kg，24h后重復給藥一次，在第二次注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，立即臀肌注射甲基強的松龍40mg/kg，共三次，每次間隔24h。將動物在最后一次注射藥物后6周靜脈注射氣栓處死，取股骨頭標本做組織學檢查。通過X線照相、CT、MRI和骨組織形態(tài)學檢查、超微結(jié)構(gòu)檢查鑒定股骨頭壞死模型成功建立。本方法能誘導出典型的兔早期股骨頭缺血性壞死模型，成功率高，重復性好。 2.應(yīng)用高能震波治療兔股骨頭缺血性壞死，觀察高能震波對股骨頭微血管

5、、骨結(jié)構(gòu)的重建及組織細胞的影響。成功建立股骨頭壞死模型后，采用以色列MEDISPEC公司生產(chǎn)的Orthospec(TM)骨傷科震波治療儀進行治療實驗。治療前用脫毛劑(硫酸鋇)將兔雙髖皮膚絨毛脫凈，涂上醫(yī)用超聲耦合劑，2.5％的戊巴比妥靜脈麻醉，綁扎固定于自制兔臺上，將高能震波的焦點對準股骨頭。所有實驗兔左后腿作為治療側(cè)，用能流密度0.26mJ/mm2，頻率1Hz，沖擊量為2000次的高能震波治療，右后腿作為對照側(cè)，不予治療。應(yīng)用X線照相

6、、CT、MRI和骨組織形態(tài)學檢查、超微結(jié)構(gòu)檢查；觀察股骨頭微血管、骨結(jié)構(gòu)的重建及組織細胞治療前后改變。治療后4周，X線照相、CT、MRI示雙側(cè)股骨頭與治療前無明顯差異。治療后12周，X線檢查顯示治療側(cè)股骨頭點狀、線狀密度減低影明顯減少或消失，對照側(cè)則無明顯變化；CT示治療側(cè)股骨頭密度增加，囊狀透亮區(qū)減小或消失，對照側(cè)股骨頭密度也輕微增加，但囊狀透亮區(qū)仍存在；MRI示治療側(cè)股骨頭異常信號條帶減少或消失，對照側(cè)股骨頭T1WI和T2WI上低信

7、號條帶仍明顯存在，與治療前無明顯差異。股骨頭墨汁血管灌注檢查發(fā)現(xiàn)治療后4周治療側(cè)股骨頭微血管較對照側(cè)多，微血管密度高于對照側(cè)。治療后12周治療側(cè)股骨頭血管明顯增多、增粗，分布均勻；對照側(cè)股骨頭微血管雖較前增加，但明顯少于治療側(cè)。骨組織形態(tài)學檢查顯示治療側(cè)股骨頭與對照側(cè)相比靜態(tài)參數(shù)骨小梁面積百分數(shù)(TbAr％)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和小梁連結(jié)點數(shù)(N.Nd)和游離末端數(shù)(N.Tm)之比(NTR)均明顯增加，顯著

8、高于對照側(cè)，骨小梁間距(Tb.Sp)明顯減小，顯著低于對照側(cè)；動態(tài)骨形成參數(shù)熒光標記周長百分率(％L.Pm)、二次熒光標記間距(IrL.Wi)和骨形成率(BFR/BV)也顯著增加。治療側(cè)股骨頭四環(huán)素染色強，雙標記線多，雙標記線間距寬，骨小梁較寬，排列緊密，類骨質(zhì)豐富；而對照側(cè)股骨頭熒光染色淺，雙標記線少，雙標記線間距窄，骨小梁細而排列稀疏，類骨質(zhì)少見。透射電鏡觀察可見高能震波治療后成骨細胞的數(shù)量增加，細胞體積大，呈圓形或橢圓形，線粒體豐

9、富，胞漿內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，成骨細胞的這些形態(tài)特點說明成骨細胞的功能活躍。結(jié)果證實高能震波治療能夠有效促進成骨細胞的分化、增殖，改善成骨細胞的功能狀態(tài)，同時增加股骨頭微血管的生成，促進股骨頭骨的生成和骨結(jié)構(gòu)的重建。 3.應(yīng)用高能震波治療兔股骨頭缺血性壞死，觀察高能震波對股骨頭骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)及其基因表達的影響。成功建立股骨頭壞死模型后，采用以色列MEDISPEC公司生產(chǎn)的Ortho

10、spec(TM)骨傷科震波治療儀進行治療實驗。治療前用脫毛劑(硫酸鋇)將兔雙髖皮膚絨毛脫凈，涂上醫(yī)用超聲耦合劑，2.5％的戊巴比妥靜脈麻醉，綁扎固定于自制兔臺上，將高能震波的焦點對準股骨頭。所有實驗兔左后腿作為治療側(cè)，用能流密度0.26mJ./mm2，頻率1Hz，沖擊量為2000次的高能震波治療，右后腿作為對照側(cè)，不予治療。治療后24小時和第1，2，4，8，12周各取6只動物處死，取股骨頭標本行實時熒光定量PCR、免疫組化和wester

11、n-blot分析，檢測BMP-2和VEGF的mRNA和蛋白表達水平，評估高能震波對股骨頭BMP-2和VEGF及其基因表達的影響。免疫組化顯示對照側(cè)股骨頭軟骨下骨組織中成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞有少量VEGF的陽性表達，成骨細胞和成纖維細胞有少量BMP-2的陽性表達。高能震波治療后2-4周，成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達增強，成骨細胞和成纖維細胞BMP-2的表達增強。治療后8周，纖維肉芽組織中的成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞有VEGF的強陽性

12、表達，骨基質(zhì)和骨細胞也有VEGF的陽性表達；成纖維細胞BMP-2的表達呈強陽性染色，骨基質(zhì)中也有BMP-2的陽性表達。治療后12周，骨小梁和骨髓中均有VEGF和BMP-2的表達，沿骨小梁排列的成骨細胞VEGF和BMP-2的表達呈強陽性。治療后4-12周，治療側(cè)股骨頭VEGF和BMP-2的平均染色面積百分比和平均吸光度均顯著高于對照側(cè)。實時熒光定量PCR證實高能震波治療顯著增加了兔股骨頭骨組織中VEGF和BMP-2mRNA的表達，治療側(cè)股

13、骨頭VEGFmRNA的表達在治療后第1，2，4和8周顯著高于對照側(cè)，在治療后第2周VEGFmRNA的表達最高；治療側(cè)股骨頭BMP-2mRNA的表達在治療后第24小時以及第1，2，4，8周顯著高于對照側(cè)，在治療后第1周BMP-2mRNA的表達最高。Western-blot分析發(fā)現(xiàn)高能震波治療顯著增加了兔股骨頭骨組織中VEGF和BMP-2蛋白的表達，治療側(cè)股骨頭VEGF蛋白的表達在治療后第2，4，8和12周顯著高于對照側(cè)，在治療后第4周VE

14、GF蛋白的表達最高；治療側(cè)股骨頭BMP-2蛋白的表達在治療后第1，2，4，8周顯著高于對照側(cè)，在治療后第2周BMP-2蛋白的表達最高。結(jié)果證實高能震波治療能夠顯著增加兔股骨頭BMP-2和VEGF及其基因的表達，這些細胞因子表達的增加對促進股骨頭的血管生成和骨修復具有重要作用，在分子水平上證實高能震波治療股骨頭壞死是有效的，為高能震波治療股骨頭壞死提供了堅實的理論基礎(chǔ)。 4.應(yīng)用不同能量強度和劑量高能震波治療股骨頭壞死，確立高能震

15、波治療股骨頭壞死的最佳能量強度和劑量參數(shù)。成功建立股骨頭壞死模型后，采用以色列MEDISPEC公司生產(chǎn)的Orthospec(TM)骨傷科震波治療儀進行治療實驗。治療前用脫毛劑(硫酸鋇)將兔雙髖皮膚絨毛脫凈，2.5％戊巴比妥麻醉，綁扎固定于自制兔臺上，將高能震波的焦點對準股骨頭。所有實驗兔左后腿作為治療側(cè)。將股骨頭壞死動物模型隨機分為七組(A、B、C、D、E、F和G)，其中A、B、C、D組分別用能量流密度為0.16mJ/mm2、0.21m

16、J/mm2、0.26mJ/mm2和0.32mJ/mm2的沖擊波治療，沖擊次數(shù)均為2000次；E和F組均用能量流密度為0.26mJ/mm2的沖擊波治療，沖擊次數(shù)分別為1000次和4000次，G組為對照組，不予治療。治療后通過股骨頭墨汁血管灌注檢查、骨組織形態(tài)學檢查和超微結(jié)構(gòu)檢查，觀察股骨頭微血管、骨結(jié)構(gòu)的重建及組織細胞治療前后改變。股骨頭墨汁血管灌注檢查發(fā)現(xiàn)治療后12周，B、C、D、和F組股骨頭血管明顯增多、增粗，分布均勻；A和E組股骨頭

17、微血管纖細，無明顯增加。骨組織形態(tài)學檢查顯示治療后12周，B、C、D、和F組股骨頭骨小梁增粗，骨小梁面積百分比顯著高于G組，A和E組股骨頭骨小梁稀疏，骨小梁面積百分比無明顯增加。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，高能震波治療后B、C、D、和F組股骨頭成骨細胞呈圓形或橢圓形，細胞體積大，胞漿內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成附有核糖體的膜狀管，線粒體數(shù)量多，核染色淡，結(jié)構(gòu)完整。內(nèi)皮細胞核染色淺，胞質(zhì)豐富，含有大量細胞器。結(jié)果證實：應(yīng)用高能震波治療兔早期股骨頭壞死，