胰島素受體基因的變異與結(jié)直腸癌易感性的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。近年來，胰島素信號傳導通路以及胰島素樣生長因子(IGF)家族被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色，而2型糖尿病、胰島素抵抗則會增加結(jié)直腸腫瘤的易感性，因此胰島素受體(IR)與結(jié)直腸腫瘤之間的相關(guān)性研究也逐漸引起關(guān)注。IR是細胞膜表面一種重要的大分子跨膜糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞的代謝和生長、增殖、分化。胰島素受體基因(INSR)位于人基因組19p13.3-13.2區(qū)，由22個外顯子和2

2、1個內(nèi)含子組成，其第1-11號外顯子編碼α亞基，第12-22號外顯子編碼β亞基。編碼α亞基C端12個氨基酸殘基的第11號外顯子因為會被變異性剪接，而使INSR存在兩種mRNA：缺少第11號外顯子的mRNA(EX11-)，翻譯的IR稱為IRA；含有第11號外顯子的mRNA(EX11+)，翻譯的IR稱為IRB。兩種受體在人體組織中的分布存在顯著差異，IRA在人體多種惡性細胞中高表達，包括結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、平滑肌肉瘤等

3、，IRA可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是基因組中最普遍的一種變異形式。SNPs不僅可以作為遺傳標記，通過連鎖或關(guān)聯(lián)分析定位疾病易感基因，而且有些SNPs本身就可直接導致疾病或引起藥物/毒物反應性的差異，因此，SNPs對多基因疾病的早期風險性評估、早期診斷和治療以及藥物基因組學等方面均有巨大的應用價值。 我們分別從基因因素和代謝因素

4、兩方面探討胰島素受體基因的變異對結(jié)直腸癌易感性的影響以及可能的機制。 由于INSR基因編碼區(qū)的SNPs在中國漢族人群中總的分布情況，以及這些SNPs與結(jié)直腸癌的相關(guān)性分析目前罕有報道，因此我們選擇了100例中國漢族正常人和100例2000年至2004年在浙江大學附屬醫(yī)院住院的經(jīng)病理診斷確診為結(jié)直腸癌的患者作為研究對象，分別檢測了編碼IR主要功能部位的13個外顯子的SNPs在中國漢族正常人和結(jié)直腸癌患者中的分布情況(其中exon2

5、-6主要編碼胰島素結(jié)合部位，exon12編碼IRβ亞基的起始部位，exon17-22編碼IR的酪氨酸激酶活性部位，exon11則會影響IR的變異性剪接)。我們還對本次研究中發(fā)現(xiàn)的SNPs在結(jié)直腸癌患者和正常人群中基因型分布的差異進行了分析。 通過變性高效液相色譜(DHPLC)結(jié)合測序的SNP技術(shù)分析平臺，我們在INSR的13個外顯子中共發(fā)現(xiàn)了5個SNPs和1個突變，其中1個SNPs和1個突變是首次被發(fā)現(xiàn)。我們比較了這些SNPs位

6、點在中國正常人群和結(jié)直腸癌患者中基因型頻率的分布，以及它們與腫瘤患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)侵犯、Dukes分期等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)這些SNPs位點的基因型分布在兩組間有顯著差異，但發(fā)現(xiàn)261(C/T)位點的基因型頻率分布在腫瘤的發(fā)生部位之間有顯著統(tǒng)計學差異，提示261(C/T)位點可能與腫瘤的發(fā)生部位有關(guān)。 此外，IRAA在人體大多數(shù)分化成熟的組織中低表達，而在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多

7、種惡性腫瘤中表達顯著升高，其機制目前尚未明確。我們分別就基因因素和代謝因素可能對結(jié)直腸癌中IR變異性剪接的影響展開了研究。國外有文獻報道INSR的intron10中存在多個影響exon11剪接的區(qū)域，其中intron10的5'端有一個剪接增強子區(qū)，能促進exon11被保留；其3'端潛在的分支位點上游有一個43個核苷酸序列能促進exon11被剪切；當3'端潛在的分支位點被敲除后，細胞則幾乎完全表達IRA。SNPs位點rs3745548(A

8、/G)正位于intron10的5'端剪接增強子區(qū)，而rs2252673(C/G)則位于intron11的5'剪接位點區(qū)。既然IRA在結(jié)直腸癌中表達顯著上調(diào)，我們也初步分析了這兩SNPs在結(jié)直腸癌患者和正常人中的基因型頻率分布情況。運用DHPLC技術(shù)，我們在intron10和intron11中檢測到了這兩個SNPs位點，且兩個位點在中國漢族人群中的雜合率均較高，經(jīng)統(tǒng)計分析，我們發(fā)現(xiàn)rs3745548(A/G)位點AA基因型的腫瘤患者更容易

9、發(fā)生淋巴結(jié)累及，提示AA基因型與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，其機制是否是因為該位點位于剪接增強子區(qū)，會影響結(jié)直腸癌中IR的變異性剪接，有待進一步分析。我們用這兩個高度連鎖不平衡的SNPs位點構(gòu)成單體型，分析了其與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A-G單體型與結(jié)直腸癌腫瘤的低分化程度和高浸潤能力呈正相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)會增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風險。 隨后，我們研究了胰島素、葡萄糖，兩個IR功能重要組成部分的代謝因子，對結(jié)直腸癌中IR的變異性剪接的調(diào)

10、節(jié)作用，進而推測它們是否可能是影響糖尿病患者的結(jié)直腸癌易感性的原因。我們用胰島素和高濃度葡萄糖分別處理結(jié)直腸癌細胞系RKO和SW620，并用兩種檢測方法，半定量RT-PCR和DHPLC的定量分析程序，檢測藥物處理前后IRA/IRB的表達比例變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素以及高糖處理RKO、SW620細胞后IRA表達均顯著上調(diào)。這個結(jié)果說明，胰島素和高糖均會影響結(jié)直腸癌中IR第11號外顯子的變異性剪接，主要會導致IRA表達上調(diào)。高胰島素血癥和高糖

11、血癥是2型糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，因此我們的實驗結(jié)果也提示，2型糖尿病患者出現(xiàn)的高胰島素、高糖血癥導致IRA表達上調(diào)，可能是其結(jié)直腸癌發(fā)病風險增加的重要原因。 綜上所述，我們可以得出以下結(jié)論：1.INSR基因的SNPs位點，261(C/T)、1085(C/T)、rs1051690(G/A)、rs3745548(A/G)、rs2252673(C/G)，以及rs3745548(A/G)和rs2252673(C/G)構(gòu)成的單體型與結(jié)直腸

12、癌的易感性之間沒有相關(guān)性，提示INSR基因水平的多態(tài)性可能不是影響結(jié)直腸癌易感性的主要因素。 2.多態(tài)位點261(C/T)與結(jié)直腸癌的發(fā)生部位之間有相關(guān)性，而rs3745548(A/0G)的AA基因型則可能會影響結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)累及。 3.多態(tài)位點rs1051690(G/A)、rs3745548(A/G)構(gòu)成的單體型的A-G基因型與結(jié)直腸癌腫瘤的低分化程度和高浸潤能力呈正相關(guān)性。 4.代謝因素，胰島素和高糖，均會