復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏抗急性肝損傷作用及對炎癥干預(yù)作用的機制研究.pdf

1、很多因素都可以引起肝臟損傷，包括外傷導(dǎo)致的肝損傷、化學(xué)性肝損傷(包括藥物性肝損傷和非藥物性肝損傷，主要是由于平時用藥及酒精等因素造成的肝臟損傷)以及病毒性肝炎所導(dǎo)致的肝損傷等。其中以病毒性肝炎引起的肝損傷最為常見。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，根據(jù)1992-1995年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查，人群HBsAg攜帶率達9.75％，約1.2億人。探討中藥對肝臟的保護作用以及抗炎的機制對開發(fā)新的抗肝炎藥物有重要意義。近年的研究表明：肝炎的發(fā)生

2、機制除與引起炎癥的病毒有關(guān)外，還與機體的免疫機制引起的肝臟損傷有關(guān)。炎癥的組織學(xué)特征是炎性細胞浸潤，細胞因子、炎癥介質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子等都在肝炎發(fā)病的病理過程中起關(guān)鍵性作用。 小花清風(fēng)藤(Sabia.parvifloraWall.exRoxb)為苗族民間藥物，是清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物，主要分布于云南、廣西、貴州等地，以前的研究資料表明，其對甲肝及乙肝的治療效果均較顯著，有很好的利濕退黃和降轉(zhuǎn)氨酶作用。但相關(guān)的藥理研究資料極少。貴州省

3、科技產(chǎn)業(yè)廳立項，對該藥進行化學(xué)和活性的系統(tǒng)研究，并研制抗肝損傷的新藥。復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏主要由小花清風(fēng)藤、三七、石斛組成，有清肝利膽的功效，主要用于治療病毒性肝炎。 本研究采用四氯化碳、α-萘異硫氰酸酯、D-氨基半乳糖、卡介苗聯(lián)合脂多糖誘發(fā)四種肝損傷模型，采用生物化學(xué)、酶聯(lián)免疫分析、免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等手段，從肝臟功能、脂質(zhì)過氧化、細胞因子的表達、肝細胞凋亡以及轉(zhuǎn)錄因子的活化等環(huán)節(jié)探討了復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏對不同肝損

4、傷模型的保護作用及其對炎癥干預(yù)作用的相關(guān)機制。 第一部分復(fù)方小花清風(fēng)藤對急性肝損傷動物模型的保護作用1復(fù)方小花清風(fēng)藤對四氯化碳(CCL4)、α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致小鼠肝損傷模型的保護作用目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對四氯化碳致急性化學(xué)性肝損傷模型及α-萘異硫氰酸酯致膽?zhàn)霭Y模型小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶及膽紅素含量的影響，探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對肝細胞膜通透性和膽汁排泄功能的影響。 方法：分別采用四氯化碳皮下注射、α-萘

5、異硫氰酸酯灌胃致小鼠急性肝臟損傷，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對四氯化碳致肝損傷模型小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量的影響；α-萘異硫氰酸酯致肝損傷模型小鼠血清中ALT、AST、堿性磷酸酶(ALP)及總膽紅素(T-Bil)含量的影響。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對四氯化碳、α-萘異硫氰酸酯所造成的肝臟損傷有一定的保護作用。 2復(fù)方小花清風(fēng)藤對D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型的保護作用目的：探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對D-氨

6、基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝細胞膜通透性、肝臟的合成功能、肝臟病理形態(tài)學(xué)改變及脂質(zhì)過氧化損傷的影響。 方法：采用D-氨基半乳糖腹腔注射致大鼠肝臟損傷，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對模型大鼠血清中ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALP、ALB、Glu、T-Bil含量的影響，以及肝臟中SOD和MDA含量的影響。并做HE染色、PAS染色及甲綠-派羅寧染色觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對模型大鼠肝組織病理形態(tài)、糖原及核酸合成的影響。 結(jié)論：復(fù)方小

7、花清風(fēng)藤能夠顯著減輕D-氨基半乳糖所引起的大鼠肝臟損傷，抗脂質(zhì)過氧化損傷，并改善肝臟的合成功能。 3復(fù)方小花清風(fēng)藤對卡介苗聯(lián)合脂多糖致小鼠免疫性肝損傷模型的保護作用目的：探討復(fù)方小花清風(fēng)藤對免疫性肝損傷模型小鼠肝細胞膜通透性和肝臟病理形態(tài)學(xué)改變的影響。 方法：小鼠尾靜脈注射卡介苗，12天后尾靜脈注射微量的脂多糖，造成免疫性肝損傷，4小時后取血，觀察復(fù)方小花清風(fēng)藤對模型小鼠血清中ALT、AST含量及肝臟病理組織形態(tài)學(xué)的影響

8、。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對卡介苗聯(lián)合脂多糖致小鼠免疫性肝損傷模型有一定的保護作用。 附：小花清風(fēng)藤的抗病毒實驗采用一日齡北京鴨靜脈注射乙型肝炎病毒，7天后開始給鴨口服小花清風(fēng)藤不同部位提取物，并以拉米夫定為對照藥，觀察藥物對肝炎鴨血清DHBV-DNA水平的抑制效果。實驗結(jié)果表明：小花清風(fēng)藤提取物1-2g/kg，一日2次，連續(xù)10日，對肝炎鴨血清DHBV-DNA水平的抑制效果顯著，P＜0.05-0.01，且無毒副反應(yīng)。

9、 第二部分復(fù)方小花清風(fēng)藤對肝損傷炎癥干預(yù)作用的機制研究1復(fù)方小花清風(fēng)藤對細胞因子表達的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠及免疫性肝損傷模型小鼠血清中細胞因子表達的影響。方法：采用D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型，卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，取血，分離血清，采用ELISA方法測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-18的含量。結(jié)果：復(fù)方小花清風(fēng)藤各劑量能顯著降低血清中TNF-α、IL-1

10、β、IL-8及IL-18的含量。結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可顯著抑制肝臟損傷后炎性細胞因子的高水平表達。 2復(fù)方小花清風(fēng)藤對肝細胞凋亡的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對免疫性肝損傷模型小鼠肝組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax的表達情況及肝細胞凋亡情況的影響，探討其可能的抗肝細胞凋亡作用和作用環(huán)節(jié)。 方法：用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠的免疫性肝損傷模型，4小時后取肝臟，石蠟包埋切片，進行TUNEL染色處理，以及Fas、FasL

11、、Bcl-2、Bax的免疫組織化學(xué)染色，并作圖像分析。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤對免疫性肝損傷模型小鼠肝臟的細胞凋亡有一定的抑制作用。 3復(fù)方小花清風(fēng)藤對D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子表達的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對D-氨基半乳糖致肝損傷模型大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、PPARα及PPARγ表達的影響，探討其對炎癥機制中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用。 方法：用D-氨基半乳糖誘導(dǎo)大鼠的肝損傷模型，24小時

12、后取右葉肝臟，石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)染色法，觀察肝組織核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、PPARα及PPARγ的表達情況。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可抑制肝臟損傷后NF-κB的異?；罨险{(diào)PPARα及PPARγ的表達。 4復(fù)方小花清風(fēng)藤對免疫性肝損傷模型小鼠肝組織c-mycmRNA及p38MAPK表達的影響目的：研究復(fù)方小花清風(fēng)藤對免疫性肝損傷模型小鼠肝組織p38MAPK以及c-mycmRNA表達的影響，探討其抗肝損傷和肝細胞

13、凋亡的可能作用環(huán)節(jié)。 方法：用卡介苗聯(lián)合脂多糖誘發(fā)小鼠的免疫性肝損傷模型，4小時后取右葉肝臟，以免疫組織化學(xué)染色法觀察p38MAPK的表達，以RT-PCR法研究c-mycmRNA的表達。 結(jié)論：復(fù)方小花清風(fēng)藤可以抑制免疫性肝損傷模型小鼠肝臟中p38MAPK和c-mycmRNA的表達，這可能是其抗肝損傷和肝細胞凋亡的作用機制之一。 綜上所述，復(fù)方小花清風(fēng)藤浸膏能夠?qū)辜毙愿螕p傷過程中轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素的升高，增強肝臟對

14、糖原和蛋白質(zhì)的合成，減輕脂質(zhì)過氧化損傷、有一定的保肝作用。其主要的作用機理可能和抑制炎性細胞因子的表達、NF-κB的異?；罨种苝38MAPK和c-mycmRNA的表達，上調(diào)PPARα及PPARγ的表達，抑制肝細胞凋亡等有關(guān)。 本課題的創(chuàng)新點： 1.苗藥小花清風(fēng)藤在民間多用于治療肝炎，療效確切，但是報道小花清風(fēng)藤藥理作用的相關(guān)文獻極少，只有部分文獻介紹了對其化學(xué)成分的研究。關(guān)于小花清風(fēng)藤保肝作用的動物實驗及藥理研究，尚

15、未見報道。本課題對復(fù)方小花清風(fēng)藤抗急性肝損傷的作用效果及其對炎癥的干預(yù)作用進行了探討。 2.D-氨基半乳糖致肝損傷模型是一個常用模型，本課題對D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷模型中PPAR(過氧化物酶體增殖物激活受體)及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達及藥物干預(yù)作用的實驗研究國內(nèi)尚未見報道。 3.本課題對BCG/LPS致免疫性肝損傷模型中c-mycmRNA表達、p38MAPK表達及藥物干預(yù)作用的實驗研究國內(nèi)尚未見報道，國外報道也極少